CGRP通過抑制過度自噬減輕缺氧/復氧心肌細胞損傷

趙麗 原大江

(山西醫科大學 1麻醉學系，山西 太原 030001；2第二醫院重癥醫學科)

急性心肌梗死病理過程中，梗死冠脈再通可以限制梗死范圍，改善心肌收縮功能，然而缺血心肌再灌注后會導致梗死心肌損傷程度進一步加重，降低治療的成功率，稱為缺血/再灌注(I/R)損傷〔1〕。有研究表明，自噬在心肌I/R的不同階段發揮不同的作用〔2〕。當心肌細胞處于缺血狀態時，細胞的自噬水平會適度激活，通過循環利用功能失調的胞質成分彌補線粒體損傷從而保護心肌細胞〔3〕。在再灌注過程中，過度氧化應激導致Beclin-1過表達，細胞自噬被過度激活，促進細胞重要成分過度降解和自我消化，加重心肌細胞的損傷〔4，5〕。

研究證實，當心肌缺血時心臟感覺神經在心肌組織間釋放降鈣素基因相關肽(CGRP)增加〔6〕，CGRP可激活線粒體ATP敏感性鉀通道(KATP)通道(mitoKATP通道)，穩定線粒膜電位，保護I/R心肌細胞〔7〕。研究發現，CGRP預處理與自噬密切相關〔8，9〕。本研究旨在探討CGRP的心臟保護作用是否與其抑制過度自噬有關，并探討其潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1主要試劑和儀器 H9c2大鼠心肌細胞株(武漢普賽諾公司)。CGRP、CGRP8～37(Sigma公司，美國舊金山)；無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號PYG0021，BOSTER公司)、高糖改良杜氏伊格爾培養基(DMEM,批號PYG0073，BOSTER公司)；1%青/鏈霉素雙抗(批號P1400，索萊寶公司)；胎牛血清(批號11011-8611，四季青公司)；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號C1086，碧云天公司)；p-蛋白激酶B(AKT)，AKT，p-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和mTOR(Abcam公司)〕；C3B重組兔單克隆抗體(批號3868T，CST公司)；Beclin-1兔多克隆抗體(批號11306-1-AP，proteintech公司)；Cytochrome C多克隆抗體(批號SA00001-2，proteintech公司)；HRP-標記的山羊抗兔IgG(批號SA00001-2，proteintech公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒 JC-1(批號C2006，碧云天公司)。超凈工作臺(世安，中國)；CO2細胞恒溫培養箱(型號：800WJ3423，Thermo Forna美國)；PH 儀(批號PHSJ-SF，上海精科有限公司，中國上海)；奧林巴斯OlympusDP73 熒光顯微鏡(TKO光學儀器股份有限公司，日本)。

1.2方法

1.2.1H9c2細胞培養及建立H/R模型 常規培養H9c2心肌細胞。隔2 d換液，培養3～4 d按照1∶4比例傳代，細胞常規培養至亞融合(肉眼估計>80%)，選擇生長狀態良好的細胞進行H/R處理。自制H/R盒，使用前通氮氣除去盒子中的氧氣，配制缺氧液，使用前通氮氣飽和3 h；配制復氧液，使用前通氧氣飽和30 min。缺氧培養：H9c2心肌細胞中加缺氧液于培養3 h，期間持續通入氮氣(1 L/min)至氧分壓為25 mmHg；復氧培養：加復氧液，正常培養2 h。

1.2.2實驗分組 空白對照組：正常培養；H/R組：進行H/R處理；參照文獻〔8〕，1×10-1mol/L CGRP對H/R后心肌細胞有比較顯著的保護作用，1×10-7mol/L CGRP8～37對CGRP的心肌保護有明顯的拮抗作用，本實驗選擇該濃度進行實驗。CGRP組：加入 CGRP 1×10-8mol/L作用20 min，缺氧3 h，復氧2 h；CGRP8～37組：于H/R前30 min加入1×10-7mol/L CGRP8～37作用10 min，加入CGRP作用20 min。

1.2.3臺盼藍染色檢測各組H9c2心肌細胞存活率 各組實驗完成后，收集并重懸細胞，加入臺盼藍染液，吸取少量經過染色的細胞，用血細胞計數板計數，細胞存活率=(細胞總數-藍色細胞數)/細胞總數×100%。

1.2.4TUNEL法檢測H9c2心肌細胞凋亡 實驗完成后，先利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液染細胞核，方便計數每個視野下的細胞總數，然后根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，每孔隨機選擇5個視野，熒光顯微鏡下觀察計算細胞凋亡率=陽性細胞/細胞總數×100%。

1.2.5檢測H9c2心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)活性 收集各組心肌細胞培養液，4℃離心取上清，根據LDH檢測試劑盒操作流程，繪制標準曲線，計算各組LDH活性。

1.2.6JC-I檢測H9c2心肌細胞線粒體膜電變化 根據試劑盒操作流程標記線粒體，熒光顯微鏡下觀察記錄。 ImageJ 軟件計算平均熒光強度，計算紅/綠熒光強度比值。

1.2.7Western印跡檢測Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈(LC)3、p-AKT，AKT，p-mTOR和mTOR表達量 加裂解液，冰上裂解，離心，取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白質濃度，將樣品中加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×)混勻，沸水浴，使蛋白充分變性。制備SDS-PAGE，上樣，電泳，然后轉膜。膜用TBST漂洗，封閉液封閉3 h，加入一抗(LC3B 1∶1 000；Beclin1 1∶1 000；p-AKT，AKT，p-mTOR和mTOR 1∶5 000；β-Actin 1∶2 000)，4℃搖床孵育過夜。膜漂洗后加入二抗(1∶2 000)，室溫搖床孵育2 h，將條帶放于曝光儀器平板上，將AB顯色液滴加到條帶上，曝光顯色，應用 Quantity One 軟件進行圖像量化，分析蛋白的相對表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1不同處理方法對H9c2心肌細胞存活率的影響 與空白組比較，H/R組H9c2心肌細胞存活率明顯下降(P<0.01)；與H/R組相比，CGRP組H9c2心肌細胞存活率明顯升高(P<0.01)；CGRP8～37可部分逆轉CGRP的作用，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2不同處理方法對H9c2心肌細胞凋亡率的影響 藍色熒光為視野下的所有有核細胞。綠色熒光為TUNEL染色后的陽性細胞，提示細胞凋亡。見圖1。與空白組比較，H/R組H9c2心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與H/R組比較，CGRP組H9c2心肌細胞凋亡率明顯下降(P<0.01)；與CGRP組比較，CGRP8～37組心肌細胞凋亡率明顯上升(P<0.01)。見表1。

2.3不同處理方法對H9c2心肌細胞LDH活性的影響 與空白組比較，H/R后H9C2心肌細胞LDH活性明顯升高(P<0.01)。加入CGRP預處理后細胞LDH活性明顯降低(P<0.01)。與CGRP組比較，CGRP8～37組LDH活性明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.4不同處理方法對H9c2心肌細胞線粒體膜電位的影響 與空白組比較，H/R組紅/綠熒光比值明顯下降，線粒體膜電位去極化(P<0.01)；與H/R組相比，CGRP組紅/綠熒光比值明顯升高，線粒體膜電位超極化(P<0.01)；CGRP8～37組可逆轉CGRP組的作用，差異有統計學意義(P<0.01)。表1、見圖2。

2.5不同處理方法對H9c2心肌細胞自噬標志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的影響 與空白組對比，H/R組的H9c2心肌細胞自噬標志蛋白Beclin-1表達和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯上升(P<0.01)。與H/R組比較，CGRP組的H9c2心肌細胞Beclin-1表達和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯下降(P<0.01)，CGRP8～37組可拮抗CGRP的作用，差異有統計學意義(P<0.01)。 見表1、圖3。

2.6不同處理方法對H9c2心肌細胞AKT/mTOR通路蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR表達量的影響 與空白組對比，H/R組H9c2心肌細胞p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明顯下降(P<0.01)。與H/R組比較，CGRP組p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明顯升高(P<0.01)。CGRP8～37組可拮抗CGRP的作用，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4、表2。

表1 各組心肌細胞凋亡率、凋亡率、LDH紅綠熒光自噬蛋白表達量的比較

圖1 各組H9c2心肌細胞(TUNEL染色，×200)

紅色熒光線粒體膜電位超極化，綠色熒光線粒體膜電位去極化圖2 各組H9c2心肌細胞熒光顯微鏡下線粒體膜電位(×400)

圖3 Western印跡檢測各組H9c2心肌細胞Beclin-1和 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的表達

圖4 Western印跡檢測各組H9c2心肌細胞Akt/mTOR 信號蛋白的表達

表2 CGRP對Akt/mTOR信號通路的影響

3 討 論

本研究表明，LDH的釋放量可反映細胞的損傷程度。為進一步測定細胞的損傷程度，檢測了細胞外液中LDH的濃度。結果發現，H/R后心肌細胞培養液中LDH濃度升高，CGRP預處理后LDH濃度下降，CGRP8～37可逆轉CGRP的作用，本實驗結果與之前的研究〔7〕結果一致，CGRP可減輕心肌細胞H/R損傷。

細胞凋亡存在于心肌細胞I/R損傷過程中。線粒體膜電位的下降提示細胞處于凋亡早期。本研究結果與先前CGRP保護I/R心肌細胞的報道〔10〕一致。有研究認為，在I/R心肌細胞中自噬具有調節作用，但是CGRP通過影響自噬水平減輕I/R心肌細胞損傷的報道很少。

細胞生理狀態下，自噬維持在較低的基礎水平，通過降解功能受損的蛋白質和細胞器，保持細胞內環境穩定〔9〕。細胞在營養物質匱乏、能量耗盡等應激情況下會誘導自噬發生，自噬對細胞成分降解和再循環，成為細胞暫時的營養物質來源〔11，12〕。心肌細胞I/R時會誘導過度自噬，過多的自噬小體與溶酶體結合，吞噬降解正常的細胞器及蛋白質，加重心肌細胞損傷〔13〕。LC3是自噬體形成的關鍵蛋白。當自噬激活時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇共價結合后形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜。因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬水平〔14〕。Beclin-1是一種Bcl-2相互作用蛋白，也是一種重要的自噬啟動蛋白，可與其他自噬調節蛋白結合形成蛋白復合物，調控自噬水平〔15〕。據報道，敲除Beclin-1基因可降低心肌細胞再灌注時誘導的過度自噬，改善心臟損傷〔16〕。本研究結果與先前報告一致〔17〕，同時CGRP可降低H/R心肌細胞 LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白質的表達，上述作用可被CGRP8～37抑制，由此可見，CGRP可能通過抑制H/R誘導的過度自噬從而保護H/R心肌細胞。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT/mTOR途徑在許多細胞過程和細胞功能中起著不可或缺的作用，包括腫瘤的增殖、遷移、黏附、存活和分子改變〔18，19〕。研究表明，mTOR是細胞生長的核心調節劑，它可以負性調控自噬活性〔20～22〕。越來越多的證據證明，AKT激活在I/R或H/R后的心臟保護中起著至關重要的作用〔23～25〕。本實驗結果可見，Akt/mTOR信號通路可能參與CGRP調控自噬。

綜上，在體外模型中證明，CGRP可能部分通過激活AKT/mTOR通路抑制過度自噬，從而保護H/R心肌細胞。 CGRP和自噬之間的相互作用為預防I/R誘導的心肌細胞凋亡和損傷提供了新的策略。然而，需要使用自噬激動劑和自噬抑制劑來更深入的研究評估CGRP的心臟保護作用，并且進一步闡明確切的分子機制。