三葉青黃酮通過調(diào)控miR-497表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

尚憲軍 王芳 李紅

(1濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250000；2濟(jì)南市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

肺癌是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一，由于肺癌早期臨床癥狀不明顯導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)已處于晚期，手術(shù)、化療、放療等綜合治療手段具有一定治療效果但副作用較大，患者預(yù)后較差，因而尋找安全有效的治療藥物對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義，植物提取物具有抗癌等作用，并可調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，既往研究顯示，利考查爾酮B、木犀草素、金絲桃苷等可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為從而發(fā)揮抗肺癌作用，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明〔1～4〕。三葉青是常用中草藥，其具有抗腫瘤的作用，黃酮是其主要活性成分，并可促進(jìn)胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡〔5〕。但三葉青黃酮(RTHF)抗肺癌的作用機(jī)制尚未闡明。miR-497在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中呈低表達(dá)，長鏈非編碼RNA(LncRNA)SNHG1可能通過充當(dāng)miR-497的海綿分子而抑制其表達(dá)從而促進(jìn)NSCLC的發(fā)展〔6〕。但miR-497是否可作為RTHF治療肺癌的潛在靶點(diǎn)尚未可知。本研究探討RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其對(duì)miR-497的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 2018年10月至2019年12月期間濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院診治的30例肺癌患者的癌旁組織及肺癌組織標(biāo)本，所有患者經(jīng)病理診斷為NSCLC，其中男15例，女15例，年齡56～71歲，平均(62.21±10.03)歲，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。肺癌細(xì)胞A549購自美國ATCC細(xì)胞庫；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液、胎牛血清、Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測試劑購自北京天根生化科技有限公司；miR-NC、miR-497 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-497購自廣州銳博生物科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑購自北京索萊寶科技有限公司；凋亡檢測試劑購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、p21、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；三葉青購自江西省神農(nóng)中藥飲片有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 RTHF〔7〕：精確稱量1 000 g三葉青塊根，使用60%乙醇提取兩次(90 min/次)，收集提取液并過濾，在45℃條件下將濾液進(jìn)行真空濃縮后凍干，采用HCl-Mg/AlCl3鑒定分析黃酮類物質(zhì)顯色反應(yīng)，得到RTHF 33.50 mg/g，采用HPD826吸附樹脂進(jìn)行純化，經(jīng)過洗脫液、旋蒸、真空干燥后得到RTHF的純化物，加入DMEM培養(yǎng)液制備成所需濃度(1、5、10 mg/ml)。

A549細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，加入含不同濃度(1、5、10 mg/ml)的RTHF的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記為RTHF低水平(RTHF-L)組、RTHF中水平(RTHF-M)組、RTHF高水平(RTHF-H)組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照(Con)組。使用不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與miR-NC、miR-497 mimics混合后室溫孵育5 min(A液)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑與不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液充分混合(B液)，A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min，并將其加入A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h棄上清液后更換正常培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別記為miR-NC組、miR-497組。采用上述轉(zhuǎn)染方法分別將anti-miR-NC、anti-miR-497轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞6 h后棄上清，加入含10 mg/ml RTHF的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記為RTHF+anti-miR-NC組、RTHF+anti-miR-497組。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖 取各組A549細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，加入MTT溶液(20 μl/孔)后室溫孵育4 h，棄上清后加入二甲基亞砜(DMSO，150 μl/孔)，室溫避光孵育5 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測吸光度值(OD值)并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取各組A549細(xì)胞加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作并檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-497的表達(dá)水平 采用Trizol法提取癌旁組織、肺癌組織及各組A549細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×g DNA緩沖液2 μl，10×King RT緩沖液2 μl，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μl，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μl，RNA(2 μg)，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后稀釋20倍，按照熒光定量檢測試劑盒說明書配置qRT-PCR體系及設(shè)置反應(yīng)條件，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測miR-497(內(nèi)參U6)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Western印跡檢測CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達(dá) 各組A549細(xì)胞加入500 μl RIPA蛋白裂解液后提取細(xì)胞總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)定量檢測試劑盒測定蛋白濃度后進(jìn)行變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)分離蛋白后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h后加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育過夜后使用TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h后使用TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖的影響 與Con組比較，RTHF-L組、RTHF-M組、RTHF-H組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，CyclinD1蛋白水平明顯降低，p21蛋白水平明顯升高(均P<0.05)，且RTHF-L組、RTHF-M組、RTHF-H組各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

2.2RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，RTHF-L組、RTHF-M組、RTHF-H組凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，RTHF-L組、RTHF-M組、RTHF-H組各指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖2。

圖1 各組增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖的 影響

表2 RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的 影響

圖2 RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響

2.3miR-497在肺癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織miR-497的表達(dá)水平(1.00±0.02)比較，肺癌組織中miR-497的表達(dá)水平明顯降低(0.34±0.02，P<0.05)。

2.4RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中miR-497表達(dá)的影響 與Con組對(duì)肺癌細(xì)胞A549中miR-497表達(dá)水平(1.00±0.02)比較，RTHF-L組、RTHF-M組、RTHF-H組對(duì)肺癌細(xì)胞A549中miR-497的表達(dá)水平明顯升高(1.31±0.02、2.11±0.02、3.81±0.11，P<0.05)，且RTHF-L組、RTHF-M組、RTHF-H組miR-497的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5miR-497過表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-497組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，凋亡率明顯升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平明顯降低，p21、Bax蛋白水平明顯升高(均P<0.05)，見表3、圖3。

2.6抑制miR-497表達(dá)逆轉(zhuǎn)了RTHF(5 mg/ml)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與RTHF+anti-miR-NC組比較，RTHF+anti-miR-497組細(xì)胞增殖抑制率明顯降低，凋亡率明顯降低(均P<0.05)，見表4、圖4。

表3 miR-497過表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖3 miR-497過表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表4 抑制miR-497表達(dá)逆轉(zhuǎn)了RTHF(5 mg/ml)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白的作用

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

2.7抑制miR-497表達(dá)逆轉(zhuǎn)了RTHF(5 mg/ml)對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的作用 與RTHF+anti-miR-NC組比較，RTHF+anti-miR-497組CyclinD1、Bcl-2蛋白水平明顯升高，p21、Bax蛋白水平明顯降低(均P<0.05)，見表4、圖5。

1～4：anti-miR-NC組、RTHF+anti-miR-NC組、anti-miR-497組、RTHF+anti-miR-497組圖5 Western印跡檢測各組相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

植物中的黃酮類成分對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移具有抑制作用，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔8～10〕。但RTHF對(duì)肺癌的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未闡明。RTHF可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。RTHF可能通過增加cleaved-caspase-3表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔12〕。RTHF可能通過p38MAPK途徑從而抑制白血病細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔13〕。研究表明通過抑制CyclinD1、Bcl-2表達(dá)及促進(jìn)p21、Bax表達(dá)可減弱肺癌細(xì)胞增殖能力及促進(jìn)胞凋亡〔14，15〕。本研究結(jié)果提示，RTHF可抑制肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

LncRNA TTN-AS1通過激活miR-497介導(dǎo)的磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔16〕。circ_SLC19A1通過miR-497/septin 2途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長和侵襲〔17〕。miR-497通過靶向plexinA4和CDK6抑制骨肉瘤生長和遷移〔18〕。本研究結(jié)果提示，RTHF可能通過上調(diào)miR-497的表達(dá)從而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，miR-497過表達(dá)可明顯提高肺癌細(xì)胞增殖抑制率與凋亡率，而抑制miR-497表達(dá)可明顯降低RTHF對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

綜上，RTHF可通過上調(diào)miR-497的表達(dá)從而抑制肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-497可能作為肺癌治療的潛在靶點(diǎn)，還可為進(jìn)一步闡釋RTHF治療肺癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。