miRNA-21對結直腸癌耐藥細胞ATM/CHK2/CDC25A信號通路的影響

嚴曉麗 范彥芳 嚴鵬 薛晶 鄭紀寧

(承德醫學院，河北 承德 067000)

美國癌癥協會2021年最新癌癥評估數據顯示，大腸癌發病率和死亡率在男性和女性中均位居第三位〔1〕。在我國結直腸癌發病率和死亡率均保持上升趨勢，2018年中國癌癥統計報告顯示，中國已成為全球結直腸癌每年新發病例數和死亡病例數最多的國家〔2〕。奧沙利鉑(L-OHP)是臨床治療中晚期結直腸癌的一線化療藥物，并已被推薦列入Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌的輔助治療和復發/轉移性結直腸癌的術前治療和全身系統治療方案中〔2〕。但結直腸癌患者對L-OHP產生耐藥是導致化療療效明顯降低甚至化療失敗的一個主要原因。為了提高中晚期結直腸癌患者的預期壽命和生活質量，通過尋找新的生物標志物逆轉L-OHP化療耐藥將有助于改善患者預后和治療方案的選擇。L-OHP主要通過破壞癌細胞DNA結構和功能阻止癌細胞的分裂和增殖，而DNA結構損傷主要和毛細血管擴張性共濟失調突變基因(ATM)/細胞周期檢測點激酶(CHK)2/細胞周期分裂素(CDC)25A信號通路有關。有研究顯示miRNA-21與以L-OHP為基礎化療方案的腫瘤患者的療效及預后密切相關〔3,4〕，但miRNA-21是否主要通過調控ATM/CHK2/CDC25A通路參與L-OHP化療耐藥目前尚不清楚。因此，本實驗通過研究結直腸癌L-OHP耐藥細胞株HCT116/L-OHP中miRNA-21與該信號通路中的關鍵因子ATM、CHK2、CDC25A、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2的關系，探討miRNA-21是否主要通過調控該信號通路參與結直腸癌細胞L-OHP的耐藥，進而為臨床L-OHP耐藥提供新的生物治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料 HCT116/L-OHP購于上海博谷生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)購于BI公司，RPMI1640培養基與胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA,0.05%)購于Gibco公司。總RNA抽提試劑(TRIZOL)購于Invitrogen科技公司，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購于天根生化科技有限公司，莖環法miRNA RT-PCR 定量試劑盒和莖環法miRNAs熒光擴增試劑盒均購于蘇州吉瑪基因公司。miRNA-21引物序列、miRNA-21模擬物(mimics)、miRNA-21抑制劑(inhibitors)及相應的陰性對照序列均由吉瑪基因公司設計合成，其余因子引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。RIPA裂解液購于索萊寶科技有限公司，ATM、β-actin兔抗人單克隆抗體購于ABclonal公司，CHK2、CDK2兔抗人單克隆抗體、CDC25A兔抗人多克隆抗體及二抗羊抗兔均購于碧云天生物技術有限公司，電化學發光(ECL)液購于北京普利萊基因技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HCT116/L-OHP細胞采用含10%FBS的RPMI1640完全培養基在37℃、5% CO2的細胞孵育箱內培養，待細胞覆蓋率達培養皿底的85%～90%時，用胰蛋白酶消化，以1∶3比例進行傳代。

1.2.2細胞分組及轉染 將細胞分為五組：空白對照(NC)組、mimics陰性對照(MNC)組、mimics組、inhibitors陰性對照(INC)組、inhibitors組?？瞻讓φ战M不進行轉染處理，MNC組轉染miRNA-21 mimics 陰性對照序列，mimics組轉染miRNA-21 mimics序列，INC組轉染miRNA-21 inhibitors 陰性對照序列，inhibitors組轉染miRNA-21 inhibitors序列。取對數生長期細胞，以密度約1×106個/孔的細胞數接種于6孔板中，待細胞匯合至70%～80%后進行轉染。轉染時配液：A液(Lipo2000 5 μl+無血清培養基250 μl)/孔×4個轉染組，室溫靜置5 min，B液(MNC/Mimics/INC/Inhibitors轉染序列各5 μl+無血清培養基250 μl)/孔，混合各轉染組的A液與B液后，室溫靜置20 min，分別將各組的AB混合液滴加至相應的6孔板中，轉染24 h后，細胞基本融合至85%～95%，收集細胞。

1.2.3RT-qPCR檢測相關因子mRNA表達水平 細胞RNA提?。捍囵B的細胞覆蓋率達80%～90%時，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次，用TRIZOL提取細胞總RNA。RNA濃度采用Nanodrop 2000分光光度計進行檢測，樣品純度A260/A280比值在1.8～2.1范圍內為符合標準的RNA。獨立重復實驗3次，每次實驗每個樣品做2個復孔，復孔間Ct值差異<1。以2-ΔΔCt判定目的基因的表達在實驗組中相對于對照組中的變化倍數，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。引物序列：miRNA-21正義鏈5′-TCGCCCGTAGCTTATCAGACT-3′,反義鏈5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′;U6 snRNA正義鏈5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,反義鏈5′-GGAA CGCTTCACGAATTTG-3′;ATM正義鏈5′-ATTGGCTTATACGCGCAGTG-3′,反義鏈5′-TAGAGATTCTGGATCTCCGTCA-3′;CHK2正義鏈5′-CTCGGG-ATGCGGATGTTGAG-3′,反義鏈5′-TGCTGGTAGAGGAGCTGGAT-3′;CDC25A正義鏈5′-ACCTCAGA-AGCTGTTGGGATG-3′,反義鏈5′-GTCCTAGAGAGTGCAGGCAG-3′;CDK2正義鏈5′-TGGACACTGAG-ACTGAGGGTGT-3′,反義鏈5′-TCTTGATGAGGGGAAGAGGAAT-3′;GAPDH正義鏈5′-GCACCGTCA-AGGCTGAGAAC-3′,反義鏈5′-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3′。

1.2.4Western印跡實驗 取各組對數生長期的細胞，用RIPA裂解各組細胞提取總蛋白，酶標儀測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜200 mA恒流轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，ATM、CHK2、CDC25A、CDK2一抗均以1∶1 000濃度稀釋、β-actin一抗(1∶100 000稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，15 min/次，二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL液顯影拍照。重復3次實驗。圖像采用Quantity One軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶與內參條帶的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

各組ATM、CHK2、CDC25A、CDK2 mRNA及蛋白表達比較 mimics組中ATM、CHK2、CDC25A和CDK2 mRNA及蛋白表達均明顯高于MNC組與NC組(P<0.05)；MNC組與NC組相比較，各因子 mRNA及蛋白表達水平的差異均不具有統計學意義(P>0.05)。inhibitors組中ATM、CHK2、CDC25A和CDK2 mRNA的表達均明顯低于INC組(P<0.05)；INC組與NC組相比較，各因子 mRNA及蛋白表達水平差異均不具有統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組ATM、CHK2、CDC25A 和CDK2 mRNA及蛋白表達比較

圖1 β-actin、ATM、CHK2、CDC25A、CDK2 蛋白在 各組中的表達

3 討 論

腫瘤的放化療治療多是通過誘導腫瘤細胞DNA損傷來消除腫瘤細胞。L-OHP作為一種抗腫瘤藥物被廣泛應用于治療各種癌癥，包括結直腸癌，但腫瘤細胞對L-OHP化療產生耐藥性限制了L-OHP的療效和臨床應用。L-OHP屬于第三代鉑類化療藥物，其殺傷腫瘤細胞的機制主要是通過與DNA形成加合物，引起DNA鏈間、鏈內及DNA-蛋白質交聯，干擾DNA結構和功能，致使DNA雙鏈在轉錄和翻譯過程中無法解開，阻止癌細胞的分裂和增殖，最終導致細胞周期阻滯和細胞凋亡〔5，6〕。DNA結構損傷主要和ATM/CHK2/CDC25A信號通路有關。ATM基因編碼的蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當細胞受到內外環境的不良刺激如L-OHP作用后DNA發生損傷，ATM會發生磷酸化進而誘導多個底物包括CHK2磷酸化，進一步放大DNA損傷信號并激活CDC25A。正常情況下，CDC25A在細胞分裂中期是穩定的，而在分離中期結束后便被降解。DNA損傷后，CDC25A會特異性降解，從而導致細胞周期阻滯。研究表明，CDC25A表達增強與腫瘤細胞化療耐藥密切相關，機制是通過減少G2/M期阻滯而增強了化療耐藥性，并且沉默CDC25A或用CDC25A抑制劑治療可以逆轉腫瘤細胞的耐藥性〔7〕。

研究發現，腫瘤抑制因子miRNAs可以增強腫瘤細胞對L-OHP化療的敏感性，觸發細胞凋亡和細胞周期阻滯，導致腫瘤細胞活力下降和腫瘤進展，一些miRNAs還能提高L-OHP化療的療效〔8〕。miRNA-21 是一種癌基因，其高表達與腫瘤的發生發展、轉移預后、化療耐藥等均有密切關系。研究〔9～11〕顯示，miRNA-21高表達的大腸癌患者整體生存率和無病生存率較miRNA-21低表達患者明顯下降，miRNA-21在大腸癌組織中的表達水平對于患者的整體生存和無病生存是一個獨立的預后因素。

本實驗結果表明，HCT116/L-OHP細胞株中miRNA-21的表達受到干預后，ATM/CHK2/CDC25A通路中關鍵分子的表達也隨之發生變化。過表達miRNA-21時可促進ATM的表達和下游一系列底物CHK2、CDC25A、CDK2的表達；當miRNA-21表達降低時，ATM的表達和下游一系列底物CHK2、CDC25A、CDK2的表達水平均隨之下降，說明miRNA-21參與結直腸癌L-OHP化療耐藥的作用很可能和ATM/CHK2/CDC25A信號通路有關。抑制miRNA-21的表達可阻斷ATM/CHK2/CDC25A信號通路，進而抑制耐藥細胞的無限增值。推測抑制miRNA-21將有可能成為結直腸癌L-OHP化療耐藥新的治療靶點，這也為進一步研究L-OHP的耐藥機制提供了許多預測，但這還需后續的實驗進行進一步的研究驗證。