欣力康提取物調控STAT3/NF-κB信號通路對膀胱癌細胞增殖、遷移的影響

顧紅勇 林鵬修 胡勁 吳敏紅 余知靈 劉彩玲

(宜春市人民醫院泌尿外科，江西 宜春 336000)

膀胱癌具有極高的復發率和死亡率，并且復發后的膀胱癌惡性度增高、浸潤能力增強〔1,2〕。據統計，每年患膀胱癌的患者將近40萬，而死亡人數可達15萬〔3〕。近年來，由于診斷水平的完善與提高，發病率有所降低，但該病的死亡率卻一直不下降〔4〕。研究指出，新型化療對部分膀胱癌患者有一定的療效，但是此等免疫靶向治療還是有一定的局限性，急需發現新的治療途徑和藥物〔5〕。并且探究膀胱癌的發生發展機制、尋找治療的靶點是降低膀胱癌病死率的關鍵。欣力康當中有10種藥材，其中最主要的當歸、黃芪等都是補氣養血、化瘀解毒、對癌癥放化療有一定輔助作用的藥材〔6〕。有研究表明，欣力康提取物對人腫瘤細胞增殖有一定的抑制作用，臨床研究發現，欣力康能夠抑制部分患者瘤體的生長，延緩腫瘤復發或轉移〔7,8〕。但具體的作用機制并不明確，且目前關于欣力康提取物對于膀胱癌的作用及其機制研究較少，因此本文旨在探討欣力康提取物對膀胱癌細胞增殖和遷移的影響，并研究其具體機制。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 膀胱癌細胞株5637(佰曄生物科技中心)；欣力康膠囊(貴陽新天藥業股份有限公司)；培養液(光語生物科技有限公司)；胎牛血清(九龍生物制品有限公司)；顯微鏡(無陌光學儀器有限公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、離心機(繼譜電子科技有限公司)；基質膠、Transwell侵襲室(撫生實業有限公司)；所需試劑盒、抗體(晶抗生物工程有限公司)；酶標儀、培養箱(風途實力生產廠)。

1.2細胞培養 采用含有胎牛血清的培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中保存，將其分為空白對照組和不同濃度的欣力康組，空白對照組不做培養，其余組分別加入0.5、2.0、5.0 mg/L的欣力康提取物。

1.3欣力康提取物制備 取欣力康膠囊粉末加乙醇回流提取2 h，過濾；然后將醇提后的藥渣分別加水提取2 h，過濾后沉淀，然后再次加乙醇靜置24 h，取上清液過濾，合并兩次濾液備用。

1.4測定細胞增殖能力 將細胞接種于孔板上，共3個孔，置孔板于37 ℃、5% CO2培養箱24 h后，丟棄上清，藥物組中每個孔加入200 μl改良杜氏伊格爾培養基(DMEM)稀釋的不同濃度的藥物培養12 h、24 h，空白對照組只加入 200 μl的DMEM培養，在結束前4 h 每孔加入20 μl MTT 5 g/L，4 h后棄上清液，每個孔都加入二甲基亞砜(DMSO)，測定吸光值。然后計算抑制率(%)=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD 值)×100% 。

1.5測定細胞侵襲能力 按比例加入基質膠至預冷的培養基中，取稀釋的基質膠加入板上室，將整個膜放入培養箱中，消化后再進行離心，5 min后懸浮，下室加入含血清的培養基，下室加細胞懸液，適宜環境下繼續培養24 h，最后進行沖洗、染色，顯微鏡下觀察結果。

1.6測定細胞遷移能力 每組設3個復孔，接種原則為過夜后融合率達100%，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞一次后，去除劃下的細胞，加入藥物培養基在37℃下培養24 h，拍照。

1.7測定細胞侵襲、遷移相關蛋白表達 取培養好的細胞提取總蛋白，加入PBS后煮沸，然后進行電泳分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂后封存1 h，一次加入一抗、二抗，2 h后再次洗膜，然后發光、顯影，掃視灰度值，估計蛋白水平。

1.8熒光素酶活性測定 收集細胞，以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清，然后將細胞懸液接種到培養板中培養48 h，然后加入欣力康提取物，培養1 h后計入激動劑，繼續培養，然后棄去培養基，每孔加入細胞裂解液，使細胞裂解。酶標儀檢測，計算抑制率。

1.9統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1測定細胞增殖能力 欣力康提取物對細胞增殖均有明顯抑制作用，且呈時間劑量依賴性(P<0.05)，見表1。由于欣力康提取物對細胞作用24 h后，抑制作用更強，因此后面實驗均研究24 h的結果。

表1 欣力康對細胞增殖能力的影響

2.2測定細胞侵襲能力 與空白對照組比較，欣力康不同濃度組侵襲細胞個數明顯減少，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2、圖1。

2.3測定細胞遷移能力 與空白對照組比，欣力康作用后，細胞遷移能力明顯下降，且隨著劑量的增加而明顯降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 各組細胞侵襲遷移能力及相關蛋白表達比較

圖1 各組細胞侵襲能力比較(結晶紫染色，×200)

圖2 各組細胞遷移能力(×200)

2.4測定細胞侵襲、遷移蛋白表達 與空白對照組比較，欣力康作用后，MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白相對表達量明顯下降，且隨著濃度的增加而明顯降低(P<0.05)，見表2、圖3。

1～4:空白對照組,0.5 mg/L欣力康組,2.0 mg/L欣力康組,5.0 mg/L欣力康組圖3 各組細胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達

2.5欣力康提取物對信號轉導和轉錄激活因子(STAT3)/核因子(NF)-κB信號通路活性抑制率的影響 與空白對照組比較，不同濃度的欣力康組對STAT3/NF-κB信號通路活性抑制率明顯升高，且隨著濃度的增加而明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組細胞中STAT3/NF-κB信號 通路活性抑制率比較

3 討 論

膀胱癌是發病率和死亡率極高的泌尿系統惡性瘤，該病病因復雜，又因為特別容易復發和轉移，且早期的癥狀并不明顯，許多患者診斷時已經到了晚期，因此導致治療的效果并不理想〔9〕。因此，積極尋找更加高效的膀胱癌治療方法，提高膀胱癌患者的治療效果、減少復發、改善患者生活質量顯得尤為重要〔10〕。近年來，中藥調控信號通路能夠解釋各種腫瘤的發病機制，為腫瘤的靶向治療提供了新方向，逐漸成為研究的熱點。欣力康的處方來自于苗族，屬于扶正解毒類中藥，在臨床上廣泛應用于各種癌癥的輔助治療，如肺癌、乳腺癌等等，具有增效減毒、預防腫瘤復發和轉移的功效，對膀胱癌也有一定的效果〔11〕。欣力康成分復雜，因此其對腫瘤細胞增殖的作用機制可能更復雜〔12〕。酪氨酸激酶Janus激酶(JAK)/STAT是多種低分子量可溶性蛋白質和生長所需的有機物在細胞內傳遞信號的常見方式，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及炎癥等過程，其中STAT1和STAT3是其家族2個重要成員，與腫瘤細胞增殖有密切關系〔13，14〕。NF-κB是影響細胞生存的一條重要通路。NF-κB1參與、影響細胞分裂、死亡等程序。研究表明，惡性瘤發生及進展與身體內低分子量可溶性蛋白質及其受體合成mRNA相關，而NF-κB1就是這個過程中最重要的一環〔15〕。有學者提到，NF-κB1活性與皮膚惡性瘤的發生發展密切相關，并且與其臨床分期還有一定的聯系，是預后一個監測指標〔16〕。

本研究結果提示，欣力康提取物對人膀胱癌細胞增殖有一定的抑制作用。有學者針對欣力康膠囊對肺癌細胞的影響做了研究，指出欣力康膠囊能夠抑制肺癌細胞增殖，且作用機制較復雜〔17〕。本研究結果提示，欣力康提取物對人膀胱癌細胞的侵襲能力和遷移能力均有抑制作用。大量研究表明〔18，19〕，MMP-2、MMP-9、E-cadherin與腫瘤局部侵犯或遠處轉移有一定相關性。有學者指出，MMP-2、MMP-9在腫瘤細胞中的表達量與腫瘤侵襲和轉移呈正相關，抑制其兩個蛋白的表達能夠減少癌細胞向其他組織侵襲和轉移；并且還有研究說明，E-cadherin丟失或功能抑制與腫瘤進展有關。并且，這幾個蛋白在病灶部位組織中的水平要高于病灶周邊組織〔20〕。本研究結果表明在欣力康提取物抑制膀胱癌細胞侵襲和轉移的過程中，侵襲和遷移蛋白表達的下調發揮了重要作用。STAT3/NF-κB信號通路參與腫瘤發生與發展，通過調控多種低分子量可溶性蛋白質和生長所需的有機物表達，與腫瘤細胞的分裂新生命體、局部侵犯或遠處轉移密切相關。研究指出，STAT3通路活化能夠上調MMP-2/9蛋白表達水平，增強腫瘤侵襲潛能〔21〕。本研究結果提示，欣力康膠囊抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲與遷移與STAT3/NF-κB信號通路活化有關，這與其他國內外研究〔22，23〕有一定的相通之處。也有研究說明，STAT3/NF-κB信號通路能夠調控MMP-2/9蛋白表達水平，最主要的是STAT3信號通路與活化E-cadherin表達也密切相關〔24〕。這也驗證了本文的研究結果。