QuEChERS結合在線GPC-GC-MS/MS法測定川牛膝中24種農藥殘留*

楊琴，劉明容，蒲雪，王芯

（樂山市中醫醫院，四川 樂山 614000）

道地藥材是具有中國特色、根植于中醫藥理論體系、來源于生產和用藥實踐、世人所公認的特定產區名優正品藥材的代名詞。川牛膝作為著名川產道地藥材之一，藥用歷史悠久[1]。川牛膝為莧科植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuan）的干燥根，現收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）；其味甘、微苦，性平，歸肝、腎經，具有逐瘀通經、通利關節、利尿通淋之功[2]。滕利等[3]從川牛膝分離純化了15個化合物。馬篤軍等[4]以兔骨關節炎模型從現代醫學的角度驗證了川牛膝功效成分。然而隨著時代變遷，川牛膝也存在著品種混亂、應用不當、質量標準低等現狀[5]。

由于農藥使用不當和生產環境污染等因素，中藥材中農藥殘留已經成為一個不容忽視的問題[6]。王瑩等[7]建立了符合中藥使用特點的農藥殘留風險評估體系，形成了風險評估的指導原則，用以開展中藥中農藥殘留風險評估工作。高巖等[8]對全國中藥資源普查女貞子樣品中農藥殘留進行分析，檢測出5種農藥殘留。農藥殘留進入人體蓄積后會導致多種疾病，如引發心肌炎[9]、危害神經系統、損傷內臟[10]。此外，為了推動中藥材的國際化，將中醫藥產業推向世界，中藥材的質量標準和檢測水平需要不斷提高[11]。

檢測中藥材農藥殘留的方法較多，如張慧等[12]建立了液質聯用法分析牛膝飲片中農藥殘留。此外，目前還有氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法[13]、氣質聯用法[14]、拉曼光譜法[15]等方法。電化學法[16]和酶聯免疫法應用范圍較少，同時存在假陽性和假陰性的缺點，還在進一步完善中；色譜類儀器因為價格較低、普及比較廣泛，但定性能力較差；氣質聯用法和液質聯用法被國家標準和藥典采用的越來越多，有高通量[17]、定性能力強[18]、靈敏度高等諸多優點[19]。本研究選取大多為中高毒性和使用率較高的農藥作為考察對象，建立QuECh－ERS結合在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯質譜法（GPCGC-MS/MS）測定川牛膝中24種農藥殘留的方法，旨在為中藥材的生產與質量控制提供一定的數據基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 在線GPC-GC-MS/MS系統（島津中國有限公司，型號：TQ-8040）；垂直振蕩器[睿科集團（廈門）股份有限公司，型號：V12]；高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：CHT210R）；電子天平（德國賽多利斯集團，型號：BSA224S）；氮吹儀（廣州得泰儀器科技有限公司，型號：MFV-12）；刀式研磨儀（北京格瑞德曼儀器設備有限公司，型號：HM300）。

1.2 材料 敵敵畏（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2298-2016，有效期：2022年12月20日）、滅線磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-1877-2016，有效期：2022年12月20日）、甲拌磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2294-2016，有效期：2022年12月20日）、樂果（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2286-2016，有效期：2023年6月27日）、氯唑磷（100 μg/mL，1 mL，批號：SB05-116-2008，有效期：2022年12月20日）、馬拉硫磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2293-2016，有效期：2022年12月20日）、毒死蜱（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-1869-2016，有效期：2022年12月20日）、水胺硫磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2332-2016，有效期：2022年12月20日）、甲基異柳磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2335-2016，有效期：2022年12月20日）、氟蟲腈（100μg/mL，1 mL，批號：SB05-071-2008，有效期：2022年12月20日）、腐霉利（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2338-2016，有效期：2022年12月20日）、殺撲磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2295-2016，有效期：2022年12月20日）、丙溴磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2640-2010，有效期：2022 年12 月20 日）、三唑 磷（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2650-2010，有效期：2022年12月20日）、戊唑醇（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2643-2010，有效期：2022年12月20日）、氟環唑（100 μg/mL，1 mL，批號：SB05-336-2016，有效期：2023年6月26日）、聯苯菊酯（100μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2333-2016，有效期：2022年12月20日）、甲氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2306-2016，有效期：2022年12月20日）、氯氟氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號：SB05-422-2018，有效期：2023年4月22日）、噠螨靈（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2658-2010，有效期：2023年6月26日）、腈苯唑（100 μg/mL，1 mL，批號：SB05-150-2008，有效期：2023年6月26日）、氯氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2308-2016，有效期：2022年12月20日）、氰戊菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2307-2016，有效期：2022年12月20日）、溴氰菊酯（100 μg/mL，1 mL，批號：GSB05-2310-2016，有效期：2022年12月20日）均購自農業農村部環境保護科研監測所。環氧七氯B對照品（100 μg/mL，1 mL，批號：G21120231，有效期：2023年3月1日）購自北京壇墨質檢科技股份有限公司。

乙腈、丙酮、環己烷均為色譜純，購自百靈威科技有限公司。無水硫酸鎂、無水乙酸鈉均為優級純，購自成都科龍化工試劑廠。N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠、石墨化炭黑（GCB）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

川牛膝樣品均購于樂山市各區縣藥店及中藥材公司。經李佳霖副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 氣相色質譜條件（1）進樣口：280 ℃，不分流（PTV進樣）。（2）毛細管柱：Rtx-5silMS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱溫采用梯度升溫，起始溫度40 ℃（保持1 min），以25 ℃/min升至130 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃（保持15 min）。（3）線速度：70 cm/s。（4）載氣：高純氦氣，純度大于99.999%。（5）溶劑延遲：9.5 min；離子源為EI源，溫度220 ℃；MS接口溫度為260℃。（6）PTV進樣口溫度程序：初始溫度120 ℃，保持5 min，然后以100 ℃/min升溫至250 ℃，保持27.5 min。（7）進樣口壓力程序：初始壓力120 kPa，以100 kPa/min升壓至180 kPa，保持4.4 min，然后以49.8 kPa/min降壓至120 kPa，保持27.6min。（8）隔墊吹掃程序：初始流量5.0 mL/min，進樣采集后以10 mL/min的速度降低至0mL/min，保持6min，然后以10mL/min的速度升至5mL/min，保持5 min。（9）GPC條件。色譜柱：Shodex CLNpak EV-200（2.1 mm×150 mm，16 μm）；流動相：丙酮-環己烷[V（丙酮）∶V（環己烷）=3∶7]；流速：0.1 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。在線式凝膠色譜時間控制程序見表1。

表1 在線式凝膠色譜時間控制程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取24種對照品各1支，準確移取1 mL，用丙酮-環己烷[V（丙酮）∶V（環己烷=3∶7）]稀釋定容至10 mL混勻，配制成質量濃度為10 μg/mL的對照品儲備溶液，冷藏備用。按照樣品制備處理方法，提取空白基質溶液，用于不同濃度對照品系列工作溶液的配制。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品，用研磨機制成細粉，精密稱取3 g于50 mL帶蓋離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min，-20 ℃下冷凍10 min。加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（質量比為4∶1）7.5 g，立即搖散，在振蕩器上劇烈振蕩3 min，于-20 ℃下冷卻5 min，離心（6 000 r/min）5 min，移取7 mL上層溶液，置于已預先裝有凈化材料的離心管中 [無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑（GCB）90 mg]，渦旋使充分混勻，再置于振蕩器上劇烈振蕩（500次/min）5 min使凈化完全，離心（6 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀上用40 ℃水浴濃縮至約0.2 mL，加乙腈定容至1 mL，再加入20 μL環氧七氯B作為內標，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，濾液上機測定。

2.3 前處理及質譜條件的優化 農藥殘留的檢測經常采用正己烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，但丙酮有機相與水相不易分開，乳化現象嚴重，同時丙酮目前為管制試劑，故不予以考慮。在同樣的條件下，本試驗采用正己烷、乙腈、乙酸乙酯對目標成分進行提取。結果表明：正己烷對有機氯菊酯類農藥有較好的回收率；乙酸乙酯對各農藥殘留提取率一般，回收率不穩定；乙腈對各成分均有較好的回收率，得到的溶液顏色也最淺。本研究綜合考慮將乙腈作為提取試劑。加入冰醋酸水溶液一方面可以將供試品充分浸潤，有利于乙腈的滲透，另一方面酸性條件下也使得農藥更為穩定可防止其降解。各種填料凈化劑GCB、C18和PSA的使用，可以有效吸附非極性雜質、色素、糖、脂肪等，減少基質效應和對氣質聯用儀的污染，提高檢測的靈敏度。在建立氣質聯用方法時本研究選擇農藥殘留離子碎片中質荷比大，響應高的離子進行二次碎裂，得到定性定量離子對。24種農殘保留時間和質譜參數見表2。以環氧七氯B作為內標，進一步校正各種誤差對測定結果帶來的影響，可保證結果的準確、可靠。

表2 農藥殘留保留時間和質譜參數

2.4 在線式凝膠色譜與QuEChERS方法的比較 經QuEChERS方法提取凈化后的溶液顏色深淺不一，說明仍然有干擾物存在于溶液中，也直接導致了較為明顯的基質效應。在線式凝膠滲透色譜的原理主要根據不同化合物分子量的大小進行分離，通過儀器的時間程序控制可以精確的將農藥殘留目標成分與提取液中的油脂、色素、糖類等大分子物質分離。質譜掃描圖顯示，經過在線凝膠滲透色譜再次凈化后，相比單一的QuEChERS方法，色譜圖基線更加平滑，雜峰明顯減少，降低了分析背景，靈敏度進一步得到了提高。（見圖1～2）

圖1 提取液經QuEChERS 凈化后總離子流色譜圖

圖2 提取液經QuEChERS 和在線凝膠滲透色譜凈化后總離子流色譜圖

2.5 基質效應考察 本試驗分別以純溶劑和空白基質溶液配制對照品系列工作溶液，在不經在線式凝膠滲透色譜（GPC）凈化條件下進行GC-MS/MS進樣分析，擬合線性回歸方程后，通過比較兩者斜率來評估基質效應的影響。計算公式為ME=A/B×100%，其中A為目標成分用基質溶液配制的標準曲線斜率，B為目標成分用純溶劑配制的標準曲線斜率，ME＞100%表示有基質增強效應，ME＜100%表示有基質減弱效應。分別配制低、中、高3個濃度的對照品溶液，測定并計算后結果見表3。低濃度下有15種農藥殘留存在非常明顯的基質增強效應：隨著基質濃度的升高，基質效應有減弱的趨勢，但是仍有少數農藥呈現增強的結果。為了減少基質效應對檢測結果的影響，本試驗采用空白基質溶液配制對照品溶液進行檢測。

表3 農藥殘留基質效應測定結果

2.6 線性范圍與檢測限、定量限考察 將24種農藥殘留對照品溶液用空白基質提取液稀釋成0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL的對照品系列工作溶液，加入20 μL環氧七氯B內標溶液，過微孔濾膜配制成系列基質混合對照品工作溶液，供測定用。以農藥殘留定量離子峰面積和內標物定量離子峰面積的比值為縱坐標、農藥對照品溶液質量濃度和內標物質量濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線。以3倍的S/N計算方法為檢測限，以10倍的S/N計算方法為定量限，結果見表4。在0～0.5 μg/mL質量濃度范圍內，線性關系良好，24種農藥殘留檢測限范圍為0.001～0.008 mg/kg，定量限為0.003～0.020 mg/kg。

表4 24 種農藥殘留線性范圍和檢測限、定量限

2.7 準確度與相對標準偏差考察 為驗證方法的準確性和相對標準偏差，本試驗向空白基質樣品中添加低、中、高濃度的農藥殘留對照品溶液，依照上述樣品提取方法制備提取液，上機測試，同時平行測定3次，結果見表5。加標樣品總離子流色譜圖見圖3。各農藥殘留加標回收率為68.4%～111.9%，相對標準偏差為0.7%～8.8%。樂果、氟環唑在低濃度水平下回收率稍低，可能的原因為水浴氮吹時有損失。同時各種填料凈化劑GCB、C18和PSA的使用，除了凈化樣品基質外，對目標成分也會有不同程度的吸附作用，從而造成回收率降低。

表5 加標回收率和相對標準偏差（n=3）

圖3 加標樣品總離子流色譜圖

2.8 對照品溶液及儀器穩定性考察 將空白基質配制的對照品溶液分別于0、12、24 h后進樣分析，考察對照品溶液及儀器的穩定性。圖4顯示，各檢測時間點對照品溶液峰面積均無明顯差異，說明穩定性良好。

圖4 對照品溶液及儀器穩定性

2.9 川牛膝質量分析 通過對37批次購買的川牛膝樣品進行檢測分析，有3批次川牛膝含有高于定量限的農藥殘留，包括毒死蜱、丙溴磷、聯苯菊酯、氯氰菊酯、氯氟氰菊酯。原因可能是種植戶未嚴格按照農藥使用規范施用，也有可能受到相鄰種植區間水果蔬菜噴灑農藥的污染。此外，川牛膝在低海拔與糧食作物的間種也會導致農藥殘留的檢出。

3 討 論

道地藥材是優質中藥材代名詞，傳承、發展、推廣好道地藥材離不開科學嚴謹的質量標準和有效的檢測手段[20]。目前尚未有川牛膝農藥殘留的檢測標準，故本研究建立了QuECh－ERS結合在線GPC-GC-MS/MS法測定川牛膝中24種農藥殘留的方法。

乙腈提取、QuEChERS凈化、利用在線凝膠滲透色譜都是為了減少基質效應的干擾[21]，提高目標物的富集程度和靈敏度[22]。本研究在對比了空白基質配制對照品與純溶劑配制對照品測定結果的影響后，發現川牛膝農藥殘留測定過程中存在比較嚴重的基質干擾，而空白基質配制對照品和應用在線凝膠滲透色譜可以在很大程度上減小這種效應，并且能有效避免對氣質聯用儀的污染。內標法定量能夠充分降低各種誤差對測定結果準確性的影響，同時多反應離子監測進行定量可以最大程度上避免測試時假陽性和假陰性的產生[23]。由于平衡凈化效果和時間成本的考慮，個別農藥殘留回收率稍低，但整體上線性關系、靈敏度、準確度和方法的穩定性都滿足了測定的需要，同時該方法還具有高通量、檢測時間短等優點。隨著檢測技術和監測水平的提高，越來越多的標準將采用質譜法作為主要的農藥殘留分析手段，從而促進中藥材生產種植標準化的提升。