熟黨參中5-羥甲基糠醛提取工藝優(yōu)選

呂立銘，高 娟，李大煒，侯秋苑

（1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025；2.惠州市藥用植物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 惠州 516025）

黨參又稱(chēng)上黨人參，是臨床常用的一味補(bǔ)益類(lèi)中藥，也是藥食同源性食材。來(lái)源于桔梗科植物黨參、素花黨參或川黨參的干燥根，其味性甘平，主入足太陰脾經(jīng)、手太陰肺經(jīng)，功效為補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血生津，臨床用于治療脾肺虛弱，食少便溏，咳嗽氣喘，氣血兩虧，氣短心悸，津傷口渴，內(nèi)熱消渴等癥狀[1]。黨參含有多種化學(xué)成分，諸如糖類(lèi)[2-4]、炔類(lèi)[2，3，5]、黃酮類(lèi)[2，3，6]、生物堿類(lèi)[2，3，7]、萜類(lèi)[2，3，8]和木質(zhì)素類(lèi)[2，3，9，10]等。傳統(tǒng)習(xí)慣認(rèn)為黨參以味甜者為佳，究其原因主要是黨參含有大量單糖、低聚糖等小分子糖，如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖等[2，3，11]。上述小分子糖類(lèi)成分，在炮制加工和儲(chǔ)存等過(guò)程中，都不可避免地發(fā)生美拉德反應(yīng)和糖的熱降解反應(yīng)（還原糖的分解及蔗糖的焦化）而產(chǎn)生5-羥甲基糠醛[12-13]。

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，簡(jiǎn)稱(chēng)5-HMF），是由小分子糖在高溫或弱酸等特殊環(huán)境下脫水產(chǎn)生的一種具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糠醛類(lèi)小分子化合物，是中藥常見(jiàn)的成分之一，也廣泛存在于水果、面包、蛋糕及乳制品等食品中[12-13]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，5-HMF對(duì)人體具有多種藥理作用。抗氧化活性[16-17]、抗心肌缺血作用[18-19]、改善血液流變學(xué)[20-21]，同時(shí)，5-羥甲基糠醛對(duì)人體具有一定的毒副作用，當(dāng)含量超過(guò)一定限度時(shí)，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，過(guò)量的5-羥甲基糠醛會(huì)損害人體橫紋肌、內(nèi)臟、基因和神經(jīng)等，對(duì)眼睛、皮膚、上呼吸道及黏膜有刺激作用[11，13，22，23]，是一種具有潛在安全隱患的內(nèi)源性污染物，常被作為注射液中的有害物質(zhì)加以含量控制[24]。因此，控制中藥中5-羥甲基糠醛的含量至關(guān)重要。黨參經(jīng)過(guò)清蒸加工成熟黨參后，口感更加香甜，顏色加深，5-羥甲基糠醛含量急劇增加。然而，關(guān)于熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以5-羥甲基糠醛含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用高效液相色譜法，優(yōu)選熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取工藝，為今后黨參藥材的質(zhì)量控制和安全性研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，美國(guó)），資生堂反相色譜柱Capcell pak C18色譜柱（資生堂公司，日本，型號(hào)4.6 mm×250 mm，5 μm），HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠，中國(guó)），BPG-9204A電熱式鼓風(fēng)干燥箱（上海市百典儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)），超聲清洗機(jī)PS-40A（廣東省深圳市科潔超聲科技有限公司，中國(guó)），電子天平FA2004N（上海市菁海儀器有限公司，中國(guó)）。

1.2 藥材與試劑

黨參藥材（采購(gòu)于山西省晉城市陵川縣六泉鄉(xiāng)，藥材經(jīng)廣東省惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室祁銀德教授鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosμla（Franch.）Nannf.的干燥根，其性狀符合《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）》一部的規(guī)定，5-羥甲基糠醛對(duì)照品（GC≥98%，批號(hào)：20170519，上海市金穗生物科技有限公司，中國(guó)），甲醇（分析純，廣東省汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司，中國(guó)），乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）。

2 方法

2.1 熟黨參樣品的制備

取生黨參飲片，置蒸制容器內(nèi)，隔水蒸至有香甜味時(shí)取出，干燥，得到熟黨參樣品[25]。

2.2 高效液相色譜法測(cè)定5-羥甲基糠醛的含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：資生堂反相色譜柱Capcell pak C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V乙腈∶V水=5∶95；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：常溫25℃。

2.2.2 5-羥甲基糠醛對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取對(duì)照品2.8 mg，精密吸取100 mL甲醇，溶解，搖勻，備用。

2.2.3 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL注入AgiLent 1260高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)。以5-羥甲基糠醛的進(jìn)樣量（x，mg）為橫坐標(biāo)，峰面積的積分值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 單因素試驗(yàn)法

2.3.1 提取方法的優(yōu)選

參考文獻(xiàn)[26-28]，5-羥甲基糠醛的提取方法主要有超聲波提取法、加熱回流提取法和浸漬法。以5-羥甲基糠醛的含量為指標(biāo)，對(duì)超聲波提取法、加熱回流提取法和冷浸法進(jìn)行考察，優(yōu)選提取方法。

超聲波提取法：準(zhǔn)確稱(chēng)取熟黨參粉末（過(guò)二號(hào)篩）0.50 g，精密吸取甲醇50.0 mL，準(zhǔn)確稱(chēng)定重量，常溫25℃浸泡0.5 h后，超聲0.5 h；待冷卻后，再次稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失溶劑的重量，濾過(guò)。濾渣精密加入甲醇50.0 mL，準(zhǔn)確稱(chēng)定重量，常溫25℃浸泡0.5 h后，超聲0.5 h，待冷卻后，再次稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失溶劑的重量，濾過(guò)，合并2次濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取中間續(xù)濾液備用。

加熱回流提取法：準(zhǔn)確稱(chēng)取熟黨參粉末（過(guò)二號(hào)篩）0.50 g，精密吸取甲醇50.0 mL，準(zhǔn)確稱(chēng)定重量，70℃條件下加熱回流0.5 h后，待冷卻，再次稱(chēng)定重量；用甲醇補(bǔ)足減失溶劑的重量，濾過(guò)，濾渣再精密加入甲醇50.0 mL，準(zhǔn)確稱(chēng)定重量，70℃條件下加熱回流0.5 h后，待冷卻，再次稱(chēng)定重量；用甲醇補(bǔ)足減失溶劑的重量，濾過(guò)，合并2次濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取中間續(xù)濾液備用。

浸漬法：準(zhǔn)確稱(chēng)取熟黨參粉末（過(guò)二號(hào)篩）0.50 g，精密吸取甲醇100.0 mL，密塞，準(zhǔn)確稱(chēng)定重量，常溫25℃浸泡24 h后，再次稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失溶劑的重量，濾過(guò)，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取中間續(xù)濾液備用。

不同提取方法5-羥甲基糠醛含量的比較。取上述3種供試品提取液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，精密吸取10 μL注入AgiLent 1 260高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算各樣品中5-羥甲基糠醛含量。

2.3.2 提取溶劑的優(yōu)選

準(zhǔn)確稱(chēng)取熟黨參粉末（過(guò)二號(hào)篩）0.50 g，分別以甲醇、無(wú)水乙醇、水為提取溶劑，按照液固比100∶1（mL∶g），常溫25℃超聲波提取2次，每次提取時(shí)間為0.5 h進(jìn)行試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)定提取前后重量，用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，合并2次濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。取上述3種提取液的中間續(xù)濾液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，精密吸取10 μL注入AgiLent 1260高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算不同提取溶劑中5-羥甲基糠醛含量。

2.4 多因素正交試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[8-10]，選擇對(duì)5-羥甲基糠醛提取影響較大的3個(gè)因素，即液固比（A）、提取次數(shù)（B）及提取時(shí)間（C）作為考察對(duì)象，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以5-羥甲基糠醛的含量為指標(biāo)，按3因素3水平設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9（34）因素水平表

3 結(jié)果

3.1 高效液相色譜法測(cè)定5-羥甲基糠醛的含量

5-羥甲基糠醛對(duì)照品的高效液相色譜圖如圖1所示。經(jīng)計(jì)算得知，5-羥甲基糠醛的進(jìn)樣量（x，mg）和峰面積積分值（y）呈線性關(guān)系。其回歸方程為y=5 323.8x-6.648 6，R2=0.999 9，其中x為5-羥甲基糠醛進(jìn)樣量，y為峰面積積分值，R為相關(guān)因子。結(jié)果表明5-羥甲基糠醛進(jìn)樣量在0.014～0.28 μg，其進(jìn)樣量（x，mg）和峰面積積分值（y）呈良好線性關(guān)系。

圖1 5-羥甲基糠醛對(duì)照品高效液相色譜圖

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 提取方法的確定

對(duì)比5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算各樣品中5-羥甲基糠醛的含量。結(jié)果表明采用超聲波提取法，測(cè)得5-羥甲基糠醛含量最高，提取效果最好，且該方法簡(jiǎn)單方便，安全性高，因此選擇超聲波提取法作為5-羥甲基糠醛的提取方法。不同提取方法5-羥甲基糠醛含量見(jiàn)表2。

表2 不同提取方法5-羥甲基糠醛含量（n=3）

3.2.2 提取溶劑的確定

對(duì)比5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算各樣品中5-羥甲基糠醛的含量。結(jié)果表明，采用甲醇作為提取溶劑，測(cè)得5-羥甲基糠醛含量最高，提取效果最好，因此選擇甲醇作為5-羥甲基糠醛的提取溶劑。不同提取溶劑5-羥甲基糠醛含量見(jiàn)表3。

表3 不同提取溶劑5-羥甲基糠醛含量（n=3）

3.3 多因素正交試驗(yàn)

由表4可見(jiàn)，因素A（液固比）對(duì)5-羥甲基糠醛提取效果影響最大，以后依次為因素B（提取次數(shù)）、因素C（提取時(shí)間）。提取條件的最優(yōu)組合為A2B1C2。但是考慮5-羥甲基糠醛自身性質(zhì)，兼顧試驗(yàn)效率，選擇提取工藝條件為A2B1C1，即液固比100∶1（mL∶g），提取1次，每次提取0.5 h。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取同一批次熟黨參樣品3份，根據(jù)上述所選工藝，即采用超聲波提取法，以甲醇為提取溶劑，液固比100∶1（mL∶g），提取2次，每次0.5 h進(jìn)行提取，提取液按“2.2.1”色譜條件，分別精密吸取10 μL注入Ag－iLent 1260高效液相色譜儀測(cè)定，測(cè)得5-羥甲基糠醛含量分別為4.92、4.98、4.86，平均值為4.92，證實(shí)提取效果好，并且具有良好的重復(fù)性和較高的準(zhǔn)確率，表明所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定，可作為熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取方法。熟黨參樣品中5-羥甲基糠醛高效液相色譜圖如圖2所示。

圖2 熟黨參樣品中5-羥甲基糠醛高效液相色譜圖

4 討論

由于5-羥甲基糠醛自身的光、熱等穩(wěn)定性差，需低溫避光保存，同時(shí)，5-羥甲基糠醛在與空氣接觸的過(guò)程中，醛基不穩(wěn)定，易被氧化，且其吸濕性極強(qiáng)，暴露在空氣中1 min內(nèi)即會(huì)吸水變成溶液。而5-羥甲基糠醛的水溶液穩(wěn)定性也很差，會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成乙酰丙酸和甲酸，故5-羥甲基糠醛提取溫度不宜過(guò)高，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，提取次數(shù)不宜過(guò)多。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和多因素正交試驗(yàn)優(yōu)選熟黨參中5-羥甲基糠醛的提取工藝，確定最佳提取工藝。即采用超聲提取法，以甲醇為提取溶劑，液固比100∶1（mL∶g），提取1次，每次0.5 h，優(yōu)選得到的5-羥甲基糠醛提取工藝簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為后期熟黨參中5-羥甲基糠醛的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。