基于種植環境對次生代謝產物影響下的廣陳皮與陳皮對比研究

石洪超 商雪瑩 陳明權 羅卓雅 覃仁安 何風雷 孫 東

1.廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東廣州 510288；2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510663

中藥材次生代謝物的含量和各成分間的比例，會因栽培環境條件的變化而變化[1-2]，黃璐琦等[3-4]提出道地藥材形成的逆境效應理論，也有其他學者[5-6]認為合成和積累次生代謝產物是藥用植物適應環境脅迫的策略，常見的環境脅迫包括溫度[7]、光照[8]、水分[9]、土壤因子等[10]。

不同產地的陳皮價格存在巨大差異，史料記載[11-12]橘皮以廣中來者勝，稱為廣陳皮，其中以廣東新會種植茶枝柑所產的廣陳皮質量最優，業內稱為“新會陳皮”。隨著2020 版《中華人民共和國藥典》[13]對“廣陳皮”項的修訂，廣陳皮產業得到了極大的發展。2021 年新會陳皮全行業產值已達145 億[14]，廣東省江門市地方標準《DB4407/T70-2021 地理標志產品新會陳皮》[15]中規定，在新會地理標志產品保護范圍內栽培并儲存陳化3 年以上的稱為“新會陳皮”。鑒于新會地區獨特的水土環境[16]，“廣陳皮”與其他產地的“陳皮”中次生代謝產物有所差別。目前研究已證實，新會陳皮中橙皮苷含量低于其他陳皮，但川陳皮素和橘皮素較高，且多氧基黃酮的含量較多[17-18]。因此，本研究從次生代謝產物的角度出發，探索通過比較黃酮類成分間的比值區分不同產地陳皮的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Thermo QE plus 液相色譜串聯高分辨質譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Waters H-Class UPLC-PDA Detector 超高效液相色譜（美國沃特世公司）；Waters XSelect CSH C18色譜柱（2.5 μm，3.0 mm×100 mm，美國沃特世公司）；Waters XSelect HSS T3 色譜柱（2.5 μm，3.0 mm×150 mm，美國沃特世公司）；Waters CORTECS C18色譜柱（2.7 μm，3.0 mm×150 mm，美國沃特世公司）；XPR 26/A 百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Sartorius BS420S 萬分之一電子天平；Milli-Q Reference 純水機（法國Millipore）；SB-5200 DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；WXJ型粉碎機（上海凱旋中藥機械制造有限公司）。

1.1.2 試劑與試藥

維采寧-2（純度：99.57%，批號：19121201，成都格利普生物科技有限公司）；橙皮苷（純度：96.1%，批號：110721-201617，中國食品藥品檢定研究院）；川陳皮素（純度：98.0%，批號：AF7122105，成都萊寶科技有限公司）；橘皮素（純度：98.0%，批號：AF8012603，成都萊寶科技有限公司）；甜橙黃酮（純度＞98.0%，批號：PS011272，成都普思生物科技股份有限公司）；6-去甲氧基橘皮素（純度＞98.0%，批號：PS011274，成都普思生物科技股份有限公司）；5-去甲基川陳皮素（純度＞98.0%，批號：PS020360，成都普思生物科技股份有限公司）；色譜級甲醇（德國Merck）、超純水、甲醇（廣州化學試劑廠）、磷酸、甲酸（廣州化學試劑廠）。

1.1.3 試驗樣品信息

樣品分別編號為S1～S18，樣品S1～S14 經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’的果皮，即廣陳皮，其中包括種植于新會地區的新會陳皮（S1～S8，以下簡稱“新會陳皮”）及同屬茶枝柑種植于兩廣其他地區的廣陳皮（S9～S14，以下簡稱“非新會廣陳皮”）；樣品S15～S18 經鑒定為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco 及除茶枝柑以外的其他栽培變種的果皮，即陳皮，樣品信息見表1。

表1 不同產地陳皮樣品信息表

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

取維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素標準品，精密稱定，分別用甲醇配置成濃度為0.552、0.523、0.542、0.604、0.426、0.513、0.419 mg/ml 的標準品溶液，置于4℃冰箱中保存。

取維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素標準品儲備液1 ml，加入甲醇配置為10 ml 的混合標準品溶液，用于不同產地陳皮的UPLC 圖譜研究。取橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素標準品儲備液1 ml，加入甲醇配置為10 ml 的混合標準品溶液，用于黃酮類成分分析研究。

1.2.2 供試品溶液的制備

取陳皮樣品0.5 g（過45 目篩），精密稱定，置于150 ml 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理30 min（功率300 W，頻率40 kHz），放置至室溫，稱重補重，經0.22 μm 微孔濾膜過濾即得。

1.2.3 UPLC 色譜條件

采用Waters H-Class UPLC-PDA Detector 超高效液相采集色譜圖；色譜柱：Waters XSelect CSH C18色譜柱；柱溫：30℃；流速：0.5 ml/min；進樣量：2 μl；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；洗脫程序為0～2 min 10%A，2～12 min 10%→15%A，12～17 min 15%→30%A，17～18 min 30%A，18～22 min 30%→45%A，22～23 min 45%→50%A，23～25 min 50%A；檢測波長：283 nm。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2 μl，按“1.2.3”項下色譜條件進樣6 次，分別積分并記錄橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素的峰面積值，計算相對標準偏差。

1.2.4.2 重復性試驗 精密稱取同一供試樣品（S4）6 份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液并按“1.2.3”項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，計算相對標準偏差。

1.2.4.3 穩定性試驗 取S4 供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h 按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素的峰面積相對標準偏差。

1.2.4.4 方法的耐用性考察 取S4 供試品溶液，分別在3 根不同色譜柱上進行耐用性考察。記錄在同一檢測波長下（283 nm）6 個成分峰的保留時間及峰面積，計算橙皮苷與其他5 個成分峰之間的相對保留時間比值和相對峰面積百分比，計算相對標準偏差。

1.2.5 質譜條件

采用Q Exactive Orbitrap 高分辨質譜進行質譜數據采集，檢測模式為Full MS-ddMS2，正離子模式掃描，掃描范圍為m/z 100～1 200，MS1分辨率設置為70000，MS2分辨率設置為17 500，離子源電壓為3.2 kV，毛細管離子傳輸管溫度為320℃，輔助氣加熱溫度為350℃，鞘氣流速為40 L/min，輔助氣流速為15 L/min，AGC Target 設置為1e6，Top N 設置為5，觸發MS2掃描的碰撞能量采用階梯式碎裂電壓NCE，設置為30、40、50。

1.2.6 數據分析

1.2.6.1 質譜數據 采用Compound discover 3.2 軟件進行原始Raw 質譜數據特征峰提取，特征峰元素匹配、分子式預測及同位素分布匹配的質量偏差均設置為＜5 ppm。采用mz cloud 在線數據庫和本地自建mz Vault 中藥天然產物數據庫進行特征峰鑒定，指認結果篩選標準為質量偏差＜5 ppm、符合同位素分布及mz Vault best match 數據庫匹配得分＞70 分。通過與對照品對照、譜庫檢索、裂解碎片及文獻檢索，對樣品中的化合物進行指認和確認。

1.2.6.2 液相數據 取“1.1.3”項下樣品，每個樣品平行2 份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液并按“1.2.3”項下色譜條件進行檢測，記錄6 個成分的峰面積，將6 個成分的峰面積，一個作為分子，另一個作為分母進行兩兩組合，形成比值。

2 結果

2.1 不同產地陳皮的UPLC 圖譜

不同產地陳皮的光譜吸收有差異，初步選擇8 個差別峰進行產地鑒別研究，其中采用對照品比對3 個已知峰（橙皮苷、川陳皮素和橘皮素），還有5 個未知峰需進行鑒別指認。見圖1。

圖1 S4、S12、S16 樣品UPLC 色譜圖

2.2 黃酮類成分定性分析

通過與對照品對照、譜庫檢索、裂解碎片及相關文獻，對樣品中的5 個未知峰進行化合物指認，且其均為黃酮類成分，化合物3 為甜橙黃酮，化合物4 為6-去甲氧基橘皮素，化合物5 為5-去甲基川陳皮素；同時初步指認化合物1 為柚皮素查爾酮，化合物2 為異櫻花素，但未采用對照品確認，總離子流圖及對照品對照圖譜見圖2。

圖2 正離子模式下總離子流圖

鑒于后續的研究需采用差異性黃酮類成分峰面積的比值分析，因此選擇6 個已用對照品確認的化合物，即化合物3（甜橙黃酮）、化合物4（6-去甲氧基橘皮素）、化合物5（5-去甲基川陳皮素），以及橙皮苷、川陳皮素、橘皮素進行峰面積比值分析。

2.3 不同產地陳皮樣品中黃酮類成分的比值分析

2.3.1 方法學考察

2.3.1.1 精密度試驗 橙皮苷（RSD=0.57%）、川陳皮素（RSD=0.52%）、橘皮素（RSD=0.61%）、甜橙黃酮（RSD=0.71%）、6-去甲氧基橘皮素（RSD=1.21%）、5-去甲基川陳皮素（RSD=1.45%）的RSD 值均＜2%，提示儀器的精密度良好。

2.3.1.2 重復性試驗6 個成分的峰面積RSD 值分別為1.27%、1.52%、1.33%、3.15%、4.03%、2.10%，提示方法重復性良好。

2.3.1.3 穩定性試驗6 個成分的峰面積RSD 值分別為1.03%、1.11%、0.76%、3.62%、2.57%、1.85%，提示供試品溶液在48 h 內穩定。

2.3.1.4 方法的耐用性考察 經3 根不同的色譜柱的測定結果對比發現，在色譜柱1、色譜柱2 上，6 個成分峰均能有效分離，且各差異峰的峰面積、保留時間與原方法建立時使用的色譜柱3 測定結果接近（RSD＜5%），結果見表2，提示該方法具有良好的耐用性。

表2 方法耐用性考察表

2.3.2 樣品測定

各成分峰面積經排列組合得到15 組比值，結合表1 中的樣品信息分析發現，能區分不同產地陳皮的比值有2 組，見表3。由比值數據可知，當陳皮峰面積比值甜橙黃酮/6-去甲氧基橘皮素＞0.60 時，可將其判斷為廣陳皮（包括新會陳皮、非新會產廣陳皮）；≤0.60 可將其判斷為陳皮。且當峰面積比值橘皮素/5-去甲川陳皮素＞7.00 時，可將其判斷為新會陳皮、非新會產廣陳皮；≤7.00 可將其判斷為陳皮。

表3 樣品中可用于區分的峰面積比值（n=2）

3 討論

本研究發現6 個潛在的黃酮類成分[19-20]可用于區分廣陳皮與陳皮，分別為橙皮苷、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、川陳皮素、橘皮素、5-去甲基川陳皮素，經過峰面積比值分析后發現，有2 組峰面積比值（283 nm 下）可用于判斷廣陳皮與陳皮，即甜橙黃酮/6-去甲氧基橘皮素＞0.60 或橘皮素/5-去甲基川陳皮素＞7.00，可將其判斷為廣陳皮。該比值可用于陳皮品種的快速分析，且不受陳化年份、陳化方式等因素的影響。

目前關于陳皮產地的鑒別研究中有HPLC 指紋圖譜[21]、紅外光譜[22]、礦質元素[23]、基因組DNA[24]等方法，在陳皮物質基礎方面主要有指紋圖譜及成分含量方面的研究，但指紋圖譜及含量測定[25]多存在檢測過程較冗繁或需復雜的化學計量法等問題。本研究基于中藥材次生代謝產物含量和各成分間的比例因環境條件的變化而變化，利用差異指標成分間的比例差異作為區分陳皮產地區分的指標具有一定的科學性，并且通過計算在同一檢測波長下差異成分之間的峰面積比值，可提高產地區分指標的便捷性和普適性。但對于新會陳皮和非新會廣陳皮而言，黃酮類成分比值無法對兩者進行區分，后續還需增加其他指標探索兩者區分的可能性。