基于網絡藥理學結合動物實驗探究芪玄抑甲寧治療格雷夫斯病的作用機制

高長久 丁 崧 盧 芳 柳長鳳 于棟華 劉樹民

1.黑龍江中醫藥大學研究生院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040

格雷夫斯病（Graves disease，GD）又稱毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種甲狀腺器官特異性自身免疫性疾病，其特征是促甲狀腺激素受體抗體的產生，導致甲狀腺功能亢進[1]。當前，治療GD 主要有抗甲狀腺藥物、手術和放射性碘3 種治療方式[2-3]，但存在著復發率高、易伴發甲狀腺功能減退等問題[4]。GD 屬于中醫“癭病”范疇，甲狀腺腫大為中醫之“痰凝”。本病初期多為氣機郁滯，繼而津凝痰聚，痰氣搏結頸前。日久引起血脈瘀阻，氣、痰、瘀三者常協同為患。隨著病情的進展，本病常發生病機轉化。如肝氣郁結日久可化火，火熱內盛，耗氣傷陰，導致氣陰兩虛之候[5]。驗方芪玄抑甲寧補氣滋陰、清肝降火、化痰散結，廣泛應用于臨床，并取得良好療效，其由黃芪、玄參、浙貝母、夏枯草和牡蠣5 味中藥組成，前期藥效學研究已證實其對GD 有顯著改善作用[6-8]，但其具體作用機制尚未明確。因此，本研究通過網絡藥理學預測芪玄抑甲寧治療GD 的作用機制，并對篩選的部分預測結果進行動物實驗驗證，以期初步探討芪玄抑甲寧治療GD 的作用機制，為其進一步研究奠定基礎，為中藥防治GD 提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物6 周齡SPF 級雌性BALB/c 小鼠，體重（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2021-0006。動物于溫度20～26℃、濕度40%～60%條件下適應性飼養7 d，自由進食飲水。動物實驗在黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院完成，動物使用許可證號：SYXK（黑）2018-007。動物實驗經黑龍江中醫藥大學倫理委員會批準（2021 061101）。

1.1.2 藥品與試劑 芪玄抑甲寧的組方配伍如下，黃芪∶玄參∶牡蠣∶浙貝母∶夏枯草=3∶2∶2∶2∶1（以上飲片均由黑龍江修生堂藥業有限公司提供，批號分別為20190401、20190401、20200601、20191101、20190701），按最優工藝提取藥物[9]，制備成凍干粉備用；甲巰咪唑片（Merck KGaA，批號：C10002097）；重組腺病毒Ad-TSHR-289（賽業生物科技有限公司，滴度：3.13×1011PFU/ml）；小鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：202109）；血小板內皮細胞黏附分子-1（plateletendothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）小鼠單克隆抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB12063）。

1.1.3 主要儀器 酶標儀（奧地利安圖斯公司，型號：Anthos2010）；高速冷凍離心機（安徽科大創新股份有限公司中佳分公司，型號：KDC-160HR）；脫水機（DIAPATH，型號：Donatello）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）。

1.2 研究方法

1.2.1 芪玄抑甲寧活性成分及其靶點的獲取 運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺和化學專業數據庫收集芪玄抑甲寧中5 味中藥黃芪、玄參、夏枯草、浙貝母和牡蠣的化學成分，通過口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18 篩選活性成分及其靶點[10]。

1.2.2 GD 相關靶點的獲取 運用GeneCards、在線人類孟德爾遺傳數據庫、DisGeNET、靶點數據庫和DrugBank檢索“Graves’disease”，合并去重得到GD 相關靶點。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建與核心靶點的篩選將芪玄抑甲寧相關靶點與GD 相關靶點取交集并繪制維恩圖，將共有靶點導入STRING 平臺構建PPI 網絡，選擇度值＞2 倍中位數的靶點作為核心靶點。

1.2.4 芪玄抑甲寧-活性成分-靶點網絡的構建及核心成分的篩選 將藥物、活性成分、靶點導入Cytoscape得到“芪玄抑甲寧-活性成分-靶點”網絡圖，選擇度值＞2 倍中位數的活性成分作為核心成分。

1.2.5 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 將核心靶點導入Metascape 平臺，進行GO 和KEGG 富集分析。

1.2.6 芪玄抑甲寧對GD 小鼠甲狀腺血管新生的影響前期實驗結果表明，芪玄抑甲寧對GD 模型小鼠的外觀行為、甲狀腺組織病理形態具有改善作用，并對血清中甲狀腺素、促甲狀腺激素受體抗體有回調作用，且高劑量組最顯著。本研究以前期實驗的高劑量組作為給藥組，選取網絡藥理學所預測抑制血管新生方面的機制進行驗證[8]。

1.2.7 動物分組與給藥 選取6 周齡SPF 級體重（20±2）g的雌性BALB/c 小鼠40 只，其中10 只設為正常對照組，其余30 只應用重組腺病毒Ad-TSHR-289 于小鼠脛前肌注射免疫構建GD 模型，免疫劑量為1.878×109PFU/60 μl，于1、4、7 周共免疫3 次[11-12]。第10 周采用隨機數字表法將造模成功的小鼠分為GD 模型組、甲巰咪唑組、芪玄抑甲寧組，每組8 只。芪玄抑甲寧組灌胃芪玄抑甲寧50 g/kg，甲巰咪唑組灌胃甲巰咪唑片3.75 mg/kg，正常對照組、GD 模型組灌胃同體積的飲用水，1 次/d，連續4 周。

1.2.8 芪玄抑甲寧對四組血清VEGF 的影響 給藥4 周后，將四組以0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉，于各組頜下靜脈叢采取靜脈血，取上清后采用酶聯免疫吸附試驗檢測四組血清中VEGF 含量，具體操作按照試劑盒說明書進行，并經酶標儀檢測450 nm 波長時的光密度值。

1.2.9 芪玄抑甲寧對GD 小鼠甲狀腺組織PECAM-1 的影響 對四組甲狀腺組織采用免疫組織化學法檢測PECAM-1 水平，PECAM-1 水平可反映微血管密度。按照石蠟切片免疫組化法將四組甲狀腺組織制成中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色情況，依照Weidner 標準，每張隨機選取5 個不重疊、不相鄰的視野，400 倍鏡下觀察，計算每個視野的PECAM-1 水平[13]。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7 對所得數據進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芪玄抑甲寧活性成分及其靶點

共獲得芪玄抑甲寧的活性成分63 種，靶點281 個。見圖1。

圖1 芪玄抑甲寧活性成分相關信息

2.2 GD 相關靶點及PPI 網絡與核心靶點

共獲得GD 相關靶點1 489 個，芪玄抑甲寧與GD共有靶點為124 個，見圖2。PPI 獲得111 個潛在靶點，其中核心靶點有信號轉導和轉錄激活因子3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、VEGFA 等21 個，見圖3。

圖2 芪玄抑甲寧相關靶點與格雷夫斯病相關靶點維恩圖

圖3 芪玄抑甲寧與格雷夫斯病共有靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

2.3 芪玄抑甲寧-活性成分-靶點網絡及核心成分

篩選與潛在靶點對應的活性成分，將其與5 味中藥及靶點導入Cytoscape 軟件得到“芪玄抑甲寧-活性成分-靶點”網絡圖，經篩選得到槲皮素、山柰酚、木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇等18 種核心成分。見圖4。

圖4 芪玄抑甲寧-活性成分-靶點網絡

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析獲得炎癥反應、血管新生、血管形態發生、一氧化氮合酶調節活性等954 項，見圖5。KEGG富集分析獲得MAPK、PI3K/Akt、IL-17、VEGF 等92 條信號通路，見圖6。

圖5 芪玄抑甲寧治療格雷夫斯病核心靶點的GO 富集分析

圖6 芪玄抑甲寧治療格雷夫斯病核心靶點的KEGG富集分析

2.5 四組血清VEGF 水平比較

GD 模型組血清VEGF 水平高于正常對照組，且芪玄抑甲寧組VEGF 水平低于GD 模型組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖7。

圖7 四組血清VEGF 水平比較

2.6 四組甲狀腺組織的PECAM-1 水平比較

GD 模型組血清PECAM-1 水平高于正常對照組，且芪玄抑甲寧組PECAM-1 水平低于GD 模型組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖8。

圖8 四組甲狀腺組織的PECAM-1 水平比較

3 討論

網絡藥理學從多維角度預測中藥及復方與疾病之間的相互作用關系，從而預測藥物治療疾病的作用機制，現廣泛應用于中醫藥前中期研究工作中[14-15]。本研究通過網絡藥理學構建了PPI 網絡、“芪玄抑甲寧-活性成分-靶點”網絡、GO 和KEGG 富集分析，將核心成分、核心靶點、功能和信號通路相關聯整合，揭示了芪玄抑甲寧治療GD 的作用機制主要集中在以下兩個方面。

血管新生方面，抑制甲狀腺血管新生可以縮小GD 甲狀腺體積、降低甲狀腺激素水平[16]。核心成分山柰酚能抑制血管新生，用于包括癌癥在內的許多嚴重疾病[17]，其通過靶向VEGF 受體2 調控VEGF 刺激的人臍靜脈內皮細胞中的MAPK 和PI3K/AKT 信號通路來抑制血管新生[18-19]。同時，核心成分槲皮素、熊果酸也具有抑制血管新生的作用[20]。提示芪玄抑甲寧可能通過山柰酚、槲皮素、熊果酸等成分調控VEGF受體2、MAPK 和PI3K/AKT 信號通路抑制甲狀腺的血管新生。本研究通過檢測VEGF、PECAM-1 的表達情況，提示芪玄抑甲寧可能通過降低GD 小鼠的VEGF水平，抑制甲狀腺血管翳的新生來治療GD。

甲狀腺功能方面，GD 以甲狀腺彌漫性腫大和分泌功能亢進為主要特征[21]。其核心成分槲皮素能顯著降低高脂膳食小鼠血清甲狀腺素水平，通過MAPK、甲狀腺激素合成通路預防和逆轉甲狀腺激素代謝紊亂[22-23]；山柰酚作為競爭性甲狀腺過氧化物酶抑制劑[24]，可抑制甲狀腺激素的合成。有研究顯示，富含山柰酚和槲皮素的海藻石莼提取物可顯著降低甲亢大鼠血清T3、T4和促炎性細胞因子的水平[25]。提示芪玄抑甲寧可能通過山柰酚和槲皮素等成分調控MAPK信號通路或抑制甲狀腺激素的合成，從而減輕甲狀腺功能亢進的癥狀。

綜上所述，本研究所得核心成分、靶點及信號通路與GD 的治療密切相關，發現了槲皮素、山柰酚、熊果酸等潛在活性成分，以及信號轉導和轉錄激活因子3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、VEGFA 等核心靶點，提示芪玄抑甲寧可能通過調控MAPK、PI3K/AKT 和VEGF等信號通路產生抑制血管新生等作用治療GD。然而芪玄抑甲寧治療GD 的作用機制仍需大量的體內外實驗進行闡明，本研究結果可為進一步深入探討其作用機制奠定基礎。