高通量測序結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)研究醬醪中微生物多樣性及群落變化

伍亞龍，楊愷，史莓梅，呂鵬軍，汪冬冬，李龍，唐垚，張其圣,*

1(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山，620030) 2(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院有限公司，四川 成都，611130)

醬油是一種發(fā)源自我國的傳統(tǒng)釀造調(diào)味品，又稱“醬汁”或“清醬”，距今已有2 500多年歷史，深受人們喜愛[1]。醬油發(fā)酵是一個半開放的混菌共同發(fā)酵體系，參與的微生物主要是米曲霉、酵母菌和乳酸菌。乳酸菌和酵母菌是制曲和發(fā)酵過程中從環(huán)境中帶入的微生物，微生物種群是醬油的發(fā)酵和風味物質(zhì)合成的重要影響因素之一[2]。醬醪發(fā)酵是醬油制作中最重要的階段之一，在醬油釀造中起到關(guān)鍵作用。醬醪發(fā)酵階段主要是以酵母菌和乳酸菌為主進行液體發(fā)酵，這個階段生成大量的醇類、酯類和酚類物質(zhì)以及芳香族化合物，賦予醬油特殊的香氣[3-4]。

目前微生物多樣性的研究方法主要分為傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和免培養(yǎng)方法。傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法是最常見的研究方法之一，利于了解分離純化得到的微生物的形態(tài)特征和生理特性[5]。YAN等[6]利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法對日本醬油發(fā)酵過程中微生物變化分析得出乳酸菌為優(yōu)勢菌群，其次為酵母菌和霉菌。隨著分子生物學的進步，免培養(yǎng)技術(shù)逐漸趨于成熟。近年來利用免培養(yǎng)技術(shù)研究醬油(醪)發(fā)酵過程中微生物多樣性的報道明顯增多，謝顯華[7]利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對3個月發(fā)酵周期的醬油細菌群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律進行了分析，發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬為優(yōu)勢菌屬。WANG等[8]使用宏基因組學研究醬油中細菌群落多樣性，發(fā)現(xiàn)醬醪階段存在34個細菌屬，其中以庫特菌屬、葡萄球菌屬和腸球菌屬為優(yōu)勢菌。阮志強等[9]采用高通量測序研究醬油發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化及優(yōu)勢真菌，整個發(fā)酵過程優(yōu)勢菌為曲霉屬、柯達酵母屬和結(jié)合酵母屬。

目前國內(nèi)外對醬油(醪)發(fā)酵大多采用單一分析方法對微生物多樣性進行研究，或是針對細菌或真菌的群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化研究其與風味物質(zhì)的相關(guān)性。但是，鮮有使用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)和免培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的方法探索醬醪發(fā)酵過程中細菌及真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究。本研究采用高通量測序技術(shù)和傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的手段，對醬醪在發(fā)酵過程中細菌和真菌群落的動態(tài)變化進行研究，解析不同時期醬醪中主要微生物群落的構(gòu)成，為企業(yè)提高醬油品質(zhì)及醬醪發(fā)酵時間的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 樣品采集

利用無菌袋分別對發(fā)酵時間為0、1、2、3、4、5、6個月的醬醪進行取樣，樣品采用高鹽稀態(tài)釀造工藝，四川清香園調(diào)味品有限公司。

1.1.2 實驗試劑

Bacterial DNA Isolation Kit，2× PCR Mix，成都福際生物技術(shù)公司；Biomiga EZgene TM Fungal gDNA Miniprep Kit，美國Biomiga；PCR引物，成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，成都市科龍化工有限公司；瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、高鹽MRS培養(yǎng)基(含100 g/L食鹽)、孟加拉紅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基均現(xiàn)配現(xiàn)用，其他試劑均為分析純。

1.1.3 實驗設(shè)備

T960梯度PCR熱循環(huán)儀，杭州晶格科學儀器有限公司；JY04S-3E凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀，北京市六一儀器廠；THZ-C-1臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉實驗設(shè)備廠；DHP-9080B恒溫培養(yǎng)箱，上海瑯玕實驗設(shè)備有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，江蘇蘇凈集團有限公司；ABI GeneAmp?9700 PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；TGL-20BR臺式高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，長沙精開儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醬醪中微生物計數(shù)

將1 mL醬醪加入到9 mL質(zhì)量濃度8.5 g/L無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋，并選取合適的稀釋度和培養(yǎng)基，將0.1 mL稀釋液注入90 mm培養(yǎng)皿中，采用涂布法分別對乳酸菌和酵母菌活菌計數(shù)。非嗜鹽乳酸菌選擇MRS培養(yǎng)基(添加30 g/L納他霉素)，嗜鹽乳酸菌選擇高鹽MRS培養(yǎng)基(含100 g/L食鹽)，待涂布完畢后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48 h后進行計數(shù)；酵母菌選擇孟加拉紅培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48～72 h后計數(shù)。

1.2.2 醬醪中微生物的分離、純化

非嗜鹽乳酸菌：在乳酸菌計數(shù)平板中，按菌落形態(tài)差異(形狀、顏色、大小、凸起度、干濕度、透明度、邊緣完整性)挑選菌落于MRS平板上劃線，并記錄該菌株在平板上的相似菌株數(shù)量。將菌株反復純化3～4次后，進行革蘭氏染色與接觸酶試驗，篩選出革蘭氏陽性、接觸酶陰性的無芽孢純培養(yǎng)物；將篩選出的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，然后與甘油溶液以體積比1∶1加入甘油管中(甘油最終體積分數(shù)20%)，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

嗜鹽乳酸菌：選用添加食鹽(100 g/L)的MRS培養(yǎng)基進行嗜鹽乳酸菌計數(shù)。按相同步驟進行稀釋涂布后，于30 ℃下培養(yǎng)6～7 d進行計數(shù)。分離純化，鏡檢后，將篩選出的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，然后與甘油溶液以體積比1∶1加入到甘油管中(甘油最終體積分數(shù)20%)，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

酵母菌：將計數(shù)平板中挑選的單菌落(按形狀、顏色等培養(yǎng)特征)進行3～4次劃線分離純化，于PDA培養(yǎng)基上純化。將純化后的菌株進行形態(tài)描述并進行鏡檢，觀察是否有雜菌，若有，則還需進一步劃線分離，直至為純培養(yǎng)物。將純化后的菌株接種PDA液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24～36 h后，將菌液按體積比1∶1加入到已滅菌的甘油管中(甘油最終體積分數(shù)20%)，放入-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.3 細菌16S rDNA分析

使用細菌通用引物27F和1492R對16S rDNA全長進行基因擴增，擴增后的PCR產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序，采用雙向測序法，即每株菌得到2條800～1 000 bp的片段。利用BLAST進行比對，尋找基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上查找到相關(guān)細菌模式菌株16S rDNA序列，利用Mega 5.0軟件將測序的菌株與模式菌株序列多重對比后進行系統(tǒng)進化親緣關(guān)系研究，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 真菌26S rDNA分析

采用NL1和NL4引物擴增26S rDNA片段，PCR擴增后的產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序后的結(jié)果利用BLAST進行比對，尋找基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種；從NCBI的GenBank中查找代表性序列，將其與測序序列進行多重對比后作系統(tǒng)進化親緣關(guān)系研究，利用軟件Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 高通量測序分析

樣品的高通量測序采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司MiSeq測序平臺，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，16S細菌使用Silva數(shù)據(jù)庫，ITS真菌使用Unite真菌數(shù)據(jù)庫進行比對。最后采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并統(tǒng)計每個樣品的群落組成[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬醪發(fā)酵過程中微生物菌變化分析

在醬醪發(fā)酵過程中，米曲霉通常在發(fā)酵初期由人工接種，第0月時高達108CFU/mL，但其在醬醪發(fā)酵1個月時就已消失，主要是其產(chǎn)生的蛋白酶參與后續(xù)發(fā)酵。醬醪中酵母菌和乳酸菌主要由環(huán)境帶入，故其發(fā)酵初期含量較高[11]。如圖1所示，發(fā)酵第0月時，非嗜鹽乳酸菌含量達到108CFU/mL，發(fā)酵第0～1月數(shù)量急劇下降，可能是醬醪中鹽含量較高，導致體系中非嗜鹽乳酸菌迅速死亡[12]；發(fā)酵第1～4月，非嗜鹽乳酸菌數(shù)量下降緩慢，可能是由于總酸上升，pH下降，抑制了非嗜鹽乳酸菌的生長；發(fā)酵第5月時非嗜鹽乳酸菌已消失。酵母菌發(fā)酵初期數(shù)量遠低于乳酸菌，只有106CFU/mL左右，隨著發(fā)酵的進行，數(shù)量下降，但在發(fā)酵第5月和第6月時略有升高。同非嗜鹽乳酸菌相比較，嗜鹽乳酸菌在發(fā)酵初期數(shù)量較少，但發(fā)酵1個月時，數(shù)量驟增至108CFU/mL，而后嗜鹽乳酸菌數(shù)量逐漸減少，但在發(fā)酵后期仍是醬醪中的優(yōu)勢微生物菌群，發(fā)揮主要作用，這與ZHANG等[13]的研究結(jié)果一致，并且嗜鹽乳酸菌和酵母菌存在于整個醬醪發(fā)酵過程。

圖1 醬醪發(fā)酵過程中微生物菌相變化Fig.1 Microbial phase changes during soy sauce fermentation

2.2 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法鑒定醬醪發(fā)酵過程中的非嗜鹽乳酸菌

2.2.1 非嗜鹽乳酸菌分離鑒定

從醬醪發(fā)酵各階段的樣品中分離純化得到非嗜鹽乳酸菌共計42株。測序結(jié)果通過BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，比對結(jié)果見圖2。

圖2 非嗜鹽乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of non-halophilic lactic acid bacteria

通過比對乳酸菌的16S rDNA序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，JY1R1等與模式菌株P(guān)ediococcuslolii/acidilactici的序列非常相近，同源性非常高，因此將其鑒定結(jié)果記為Pediococcuslolii/acidilactici；同理，JY1R5等菌株鑒定為Lactobacillusacidipiscis/pobuzihi，JY1R2等菌株鑒定為Enterococcussp.，JY0R6鑒定為Leuconostocpseudomesenteroides，JY0R13等菌株鑒定為Weissellacibaria，JY0R4鑒定為Weissellathailandensis，JY0R2鑒定為Weissellaparamesenteroides/hellenica。

2.2.2 醬醪發(fā)酵過程中非嗜鹽乳酸菌群落結(jié)構(gòu)以及數(shù)量變化

如圖3所示，醬醪發(fā)酵過程中，前期乳酸菌種類較后期豐富，發(fā)酵初期，Weissella比例較高，W.thailandensis，W.paramesenteroides/hellenica，W.cibaria/confusa相對豐度較高，也有一部分Leuconostocpseudomesenteroides/mesenteroides存在。發(fā)酵第1月時，Weissella和Leuconostoc均消失，Enterococcus相對豐度最高，其次是P.lolii/acidilactici，L.acidipiscis/pobuzihi也存在；發(fā)酵2～4月，僅存在L.acidipiscis/pobuzihii和Enterococcus，而L.acidipiscis/pobuzihii相對豐度遠高于Enterococcus。醬醪發(fā)酵5個月之后，未分離鑒定到非嗜鹽乳酸菌。

圖3 可培養(yǎng)方法中非嗜鹽乳酸菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Community structure of non-halophilic lactic acid bacteria in culturable medium

如圖4所示，Weissella在醬醪發(fā)酵初期，數(shù)量高達5×107CFU/mL，但在發(fā)酵第1月時就已消失，可能原因是這類菌株對高鹽環(huán)境較為敏感；P.lolii/acidilactici僅出現(xiàn)在醬醪發(fā)酵第1個月，數(shù)量約7×103CFU/mL，發(fā)酵第2個月時就已消失。Enterococcus和L.acidipiscis/pobuzihii為醬醪發(fā)酵中期的主要乳酸菌，發(fā)酵2月時數(shù)量達到最大值，隨后開始下降；發(fā)酵第1月時，Enterococcussp.數(shù)量高于L.acidipiscis/pobuzihii；發(fā)酵2～4月，L.acidipiscis/pobuzihii數(shù)量則比Enterococcus高1個數(shù)量級。醬醪發(fā)酵5～6月非嗜鹽乳酸菌消失。

圖4 可培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)勢非嗜鹽乳酸菌的數(shù)量變化Fig.4 Quantitative changes of dominant non-halophilic lactic acid bacteria in culturable medium

2.3 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法鑒定醬醪發(fā)酵過程中的酵母菌

2.3.1 醬醪發(fā)酵酵母菌分離鑒定

從醬醪發(fā)酵各階段的樣品中分離、純化后得到酵母菌共計24株，測序結(jié)果通過BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，比對結(jié)果見圖5。

圖5 酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Yeast phylogenetic tree

通過比對酵母菌的26S rDNA序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，JY2F1、JY1F4與Debaryomyceshansenii，Debaryomycesvindobonensis，Debaryomycessubglobosus等有效菌株序列同源性都較高，系統(tǒng)發(fā)育樹聚為一支，故鑒定為Debaryomycessp.；JY0F2鑒定為Candidatropicalis；JY1F1鑒定為Saccharomycescerevisiae；JY1F5鑒定為Zygosaccharomycessp.；JY0F3鑒定為Pichiakudriavzevii；JY0F1鑒定為Candidacatenulata；JY1F2鑒定為Rhodotorulamucilaginosa；JY2F2鑒定為Candidaapicola；JY1F3鑒定為Starmerellasp.。

2.3.2 醬醪發(fā)酵過程中酵母菌群落結(jié)構(gòu)

如圖6所示，酵母菌存在于醬醪發(fā)酵的整個過程，剛?cè)氤匕l(fā)酵時存在P.kudriavzevii、C.tropicalis、C.catenulate3種酵母，其中P.kudriavzevii相對豐度最高，P.kudriavzevii被發(fā)現(xiàn)普遍存在于果酒等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，是異戊醇、乙酸乙酯等風味化合物的主要來源之一[14]。發(fā)酵第3月和第6月時Debaryomyces也占有較高的豐度，ZHANG等[15]發(fā)現(xiàn)D.hansenii僅通過蛋氨酸分解代謝產(chǎn)生揮發(fā)性硫化合物，能賦予醬醪特殊的風味。發(fā)酵1～6月，Starmerella的豐度都很高，為整個醬醪發(fā)酵過程的優(yōu)勢真菌屬；而R.mucilaginosa、Zygosaccharomyces、S.cerevisiae、C.apicola等可能是發(fā)酵前期環(huán)境中偶然出現(xiàn)的菌種，在隨后的發(fā)酵中消失。

圖6 酵母菌群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Yeast community structure

2.4 高通量測序解析醬醪發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢微生物

2.4.1 樣品細菌序列信息和α多樣性分析

利用MiSeq對醬醪發(fā)酵過程中樣品進行測序，根據(jù)測序比對結(jié)果，7個樣品中含有454 470條序列，共得到838個OTUs。如表1所示，7個樣品的Coverage均在99.9%以上，說明樣品覆蓋率較高。Chao1指數(shù)和Ace代表物種豐富度，而Shannon度量表示觀察到的OTU豐度，其能同時反映豐富度和均勻度[16]。其中，樣品JY2的Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)最高，分別為155和161，說明發(fā)酵第2月時細菌物種豐富度最高；樣品JY3的OTU指數(shù)和Shannon指數(shù)最高，分別為138和2.55，說明發(fā)酵第3月時細菌多樣性最高。由此可見，不同發(fā)酵階段樣品之間的微生物多樣性以及物種豐度有一定程度的差異。醬醪發(fā)酵初期物種相對豐富，多樣性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，到第1月時物種豐富度和多樣性到達最低值，隨后在發(fā)酵第2月開始升高并且恢復到較高水平，表明細菌群落適應了發(fā)酵環(huán)境并處于動態(tài)平衡。

表1 不同樣品中α細菌多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of bacterial community in different samples

2.4.2 細菌多樣性分析

如圖7所示，從門水平看，樣品包含7個門，其中糖精細菌門(Saccharibacteria)、Spirochaetae豐度較低，不是醬醪發(fā)酵的優(yōu)勢菌群，而厚壁菌門(Firmicutes)占總序列的比例達到了94.04%，是優(yōu)勢菌群。

a-門；b-屬圖7 醬醪發(fā)酵過程中細菌群落在門和屬水平上的結(jié)構(gòu)變化Fig.7 Changes of bacterial communities at phylum and genus levels during soy sauce fermentation

從屬水平看，樣品包含86個屬，其中四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)為醬醪發(fā)酵中優(yōu)勢菌屬，分別占總序列的41.55%和25.84%，Tetragenococcus的豐度呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，且在4個月時最高，占64.43%。而Weissella在0個月時占28.65%，相對豐度較高，其后隨著發(fā)酵的進行，有減少趨勢，這與文獻報道一致[17-18]。OGASAWARA等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)Tetragenococcus與堿性蛋白酶或風味蛋白酶結(jié)合，能夠提高揮發(fā)性物質(zhì)和游離氨基酸的含量以提升醬醪的風味，TRAN等[20]的研究指出，Weissella在醬醪發(fā)酵過程中能產(chǎn)生一些有機酸，例如乙酸，以增加醬醪的特殊風味。值得注意的是，Lactobacillus在發(fā)酵2個月、3個月時豐度增高，分別為15.03%和15.69%，其后又急減，幾乎消失，原因可能是由于大多數(shù)Lactobacillus對高鹽環(huán)境耐受性低所致。

2.4.3 樣品真菌序列信息和α多樣性分析

如表2所示，利用MiSeq測序方法對醬醪發(fā)酵過程中樣品進行測序，根據(jù)測序比對結(jié)果，7個樣品中含有237 086條序列，共得到104個OTUs。7個樣品的coverage均在99%以上，說明樣品覆蓋率較高。樣品真菌群落的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)波動變化且逐漸降低，可能是由于隨著醬醪發(fā)酵的進行，發(fā)酵前期帶入的環(huán)境真菌中有部分不適應高鹽環(huán)境而逐漸消亡，耐鹽真菌開始生長繁殖所致。Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)同樣呈現(xiàn)出相似的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)合圖1真菌數(shù)量變化，發(fā)酵前期霉菌急劇減少，酵母菌也呈現(xiàn)先下降后呈平穩(wěn)的趨勢，說明前期開始生長的耐鹽真菌逐步成為優(yōu)勢菌，而不耐鹽真菌則出現(xiàn)消亡，真菌數(shù)量處于動態(tài)平衡，但物種多樣性降低。

2.4.4 真菌多樣性分析

如圖8所示，從門水平看，Ascomycota(子囊菌門)占總序列的99.83%，為優(yōu)勢菌群。WEI等[21]所檢測出的真菌種類皆屬于Ascomycota，與本研究結(jié)果相似。從屬水平看，Aspergillus0個月時相對豐富度很高，此時人工接種的米曲霉剛?cè)氚l(fā)酵池；其后在發(fā)酵過程中逐漸減少，直至幾乎消失。而Starmerella相對豐度逐漸增高，在發(fā)酵3月、4月時最高，到6月又降低，此時未有分類信息的環(huán)境微生物占據(jù)了62.75%。Candida的豐富度也呈現(xiàn)先增后降的趨勢，但規(guī)律不是很明顯。其余菌屬占比較少，無規(guī)律可循。從整個發(fā)酵過程中可以看出Starmerella為優(yōu)勢菌屬。目前鮮有文獻對醬油發(fā)酵過程中的Starmerella

a-門；b-屬圖8 醬醪發(fā)酵過程中細菌群落在門和屬水平上的結(jié)構(gòu)變化Fig.8 Changes of fungi communities at phylum and genus levels during soy sauce fermentation

進行報道，SULAIMAN等[22]用鳥槍宏基因組方法分析馬來西亞的中國傳統(tǒng)醬油廠0～6個月的醬醪中微生物變化，發(fā)現(xiàn)真菌主要為Candida、Starmerella和Wickerhamiella，而其中Candida為優(yōu)勢菌屬。值得一提的是，本研究是首次發(fā)現(xiàn)Starmerella在醬醪中作為優(yōu)勢真菌屬，其在醬醪發(fā)酵過程中的作用特性有待進一步探索。

3 結(jié)論

應用Illumina Miseq高通量測序和傳統(tǒng)可培養(yǎng)相結(jié)合的手段研究醬醪不同發(fā)酵階段微生物群落結(jié)構(gòu)變化及優(yōu)勢菌群，從而揭示醬醪發(fā)酵過程中微生物的演替規(guī)律，得出以下結(jié)論：

(1)基于可培養(yǎng)方法，可將整個醬醪發(fā)酵過程分為3個時期。0～1月為發(fā)酵前期，此間，霉菌逐漸消亡，非嗜鹽乳酸菌含量最高，約108CFU/mL，種類也比較豐富，其中魏斯氏菌屬(Weissellasp.)數(shù)量較高，認為啟動了發(fā)酵；2～4個月為發(fā)酵中期，乳酸菌種類和數(shù)量逐漸減少，其中腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)為優(yōu)勢菌；5～6個月為發(fā)酵后期，非嗜鹽乳酸菌逐漸消亡，嗜鹽乳酸菌和酵母菌成為主要菌群。

(2)高通量測序也可得到相似的結(jié)果，醬醪中細菌包含7個門86個屬，其中，四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)占總序列的41.55%，魏斯氏菌屬(Weissella)占25.84%，葡萄球菌屬(Staphylococcus)占16.81%，乳桿菌屬(Lactobacillus)占5.04%。因此，Tetragenococcus和Weissella在醬醪發(fā)酵中為優(yōu)勢細菌屬。醬醪中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)，屬水平上以Starmerella、Candida和Aspergillus為主。從整個發(fā)酵過程中可以看出Starmerella為優(yōu)勢菌屬。當前對以Starmerella為優(yōu)勢真菌的報道幾乎沒有，其在醬醪發(fā)酵過程中的作用特性也不得而知，有待進一步研究。

通過掌握醬醪中微生物的演替規(guī)律，探究不同發(fā)酵階段微生物菌群與揮發(fā)性風味物質(zhì)、氨基酸、有機酸等理化指標的相關(guān)性。實際醬油生產(chǎn)中可通過人工添加乳酸菌、酵母菌等對發(fā)酵過程進行調(diào)控，從而達到提高醬油風味和品質(zhì)的目的。