降膽固醇乳酸菌的篩選鑒定及其性能研究
2023-02-21 10:33:24楊晴王榮春孫玥劉小琳李啟明馬鶯
食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年3期
楊晴，王榮春,2*，孫玥，劉小琳，李啟明，馬鶯,2
1(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150001)2(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 鄭州研究院，河南 鄭州，450000) 3(四川新希望乳業(yè)有限公司，四川 成都，610000)
根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，心血管疾病是造成目前全球人口的主要死因之一，每年有1 700多萬(wàn)人因此死亡[1]。同時(shí)預(yù)測(cè)心血管疾病將繼續(xù)成為人類死亡的主要原因。到2030年，全球近2 300萬(wàn)人將死于以心臟病、中風(fēng)為主的心血管疾病[2]。
高脂血癥以總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平升高以及高密度脂蛋白水平降低為特征，是引起動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅人類的健康[3]。有報(bào)告稱，血清膽固醇>5.2 mmol/L，患冠狀動(dòng)脈心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)則會(huì)增加35%，同時(shí)，降低血清中膽固醇水平的1%，可以將患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)降低2%～3%[4]。
合理飲食和適量運(yùn)動(dòng)有助于降低體內(nèi)血脂水平，但藥物治療必不可少。盡管他汀類、貝特類、煙酸類等臨床常用藥物是治療高脂血癥最快捷的途徑[5]，但是大多數(shù)化學(xué)合成的降脂藥物都存在使血清轉(zhuǎn)氨酶升高、造成肝毒性等不良反應(yīng)，需長(zhǎng)期服用藥物，費(fèi)用較高，病情易反復(fù)[6]。鑒于此，開發(fā)安全、可靠、經(jīng)濟(jì)的降血脂功能性食品對(duì)降低心血管疾病的患病率尤為重要。目前研究表明，一些發(fā)酵乳制品內(nèi)的乳酸菌具有一定的降血脂作用，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)使膽固醇的含量降低1%，心血管疾病的發(fā)病率可降低2%～3%[7]。PEREIRA等[8]發(fā)現(xiàn)分離自人體腸道中的乳酸菌和雙歧桿菌具有膽固醇同化作用。酸奶和發(fā)酵豆奶中的雙歧桿菌也被證實(shí)對(duì)高血脂癥有緩解作用。我國(guó)青藏高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳由于獨(dú)特的氣候環(huán)境以及傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源，且富有獨(dú)特的生理學(xué)特性。DING等[10]研究表明，從我國(guó)青藏高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離出的乳酸菌菌株比其他報(bào)道乳制品中分離出的乳酸菌具有更高的降膽固醇活性，這種差異可能是由于在中國(guó)青藏高原高脂肪濃度的發(fā)酵牦牛奶經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的自然選擇所致。因此，傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳成為篩選具有降血脂水平乳酸菌的寶庫(kù)。
本研究立足于青藏高原傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離純化出來(lái)的乳酸菌菌株，從中篩選出具有降膽固醇功能的益生乳酸菌，測(cè)定其體外膽固醇清除率、生長(zhǎng)性能、發(fā)酵性能、耐酸耐膽鹽能力、表面疏水性及耐藥性，以期篩選出有開發(fā)潛力并可用于功能性發(fā)酵乳生產(chǎn)的乳酸菌，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
實(shí)驗(yàn)中使用的乳酸菌菌株為本實(shí)驗(yàn)室自主分離鑒定得到；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus) CHR Hansen YOFLEX Mild 1.0；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus) CHR Hansen YOFLEX Mild 1.0。原料乳(蛋白含量3.2%，脂肪含量4.0%，總固形物12%)，收購(gòu)于當(dāng)?shù)啬翀?chǎng)。
膽固醇，Solarbio公司；牛膽鹽，上海Sigma-Aldrich公司；MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑，國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)、PT-3502C全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀，北京普天新橋技術(shù)有限公司；LD5-2A超凈工作臺(tái)，上海一恒科技有限公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 膽固醇降解率的測(cè)定
參照賀珊珊等[11]的方法加以改進(jìn)。配制200 g/L的膽固醇膠束溶液，溶液中V(吐溫-80)∶V(無(wú)水乙醇)=1∶5，80 ℃水浴加熱15 min，用微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。向MRS肉湯培養(yǎng)基中添加2.0 g/L的牛膽鹽和1.0 g/L的蔗糖脂肪酸酯，混勻后121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。將上述制備的膽固醇膠束溶液加入到MRS培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中膽固醇的終質(zhì)量濃度為1 g/L，即為高膽固醇培養(yǎng)基(MRS-CHOL培養(yǎng)基)。將活化后的乳酸菌按1×108CFU/mL的接種量接種至MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，4 000 r/min離心10 min，取上清液。以膽固醇氧化酶法測(cè)定總膽固醇，膽固醇通過(guò)膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、過(guò)氧化物酶的作用最終形成紅色醌化合物。以去除膽固醇的MRS-CHOL培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照，分別在96孔板上向酶液中加入1%(體積分?jǐn)?shù))的待測(cè)樣品上清液、實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照液、未接菌的MRS-CHOL培養(yǎng)基上清液、5.17 mmol/L膽固醇標(biāo)品和蒸餾水，37 ℃孵育10 min，用酶標(biāo)儀在510 nm下測(cè)定各孔光密度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。
待測(cè)菌株對(duì)膽固醇的降解率的計(jì)算如公式(1)和公式(2)所示：
(1)
式中：c(膽固醇)，膽固醇濃度，mmol/L;A1，待測(cè)樣品的吸光度；A2，實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照的吸光度；A3，膽固醇標(biāo)品的吸光度；A4，蒸餾水的吸光度。
(2)
式中：c0，MRS-CHOL培養(yǎng)基中的膽固醇濃度，mmol/L；c1，待測(cè)樣品上清液中的膽固醇濃度，mmol/L。
1.3.2 活菌數(shù)的測(cè)定
參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品 微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》的方法檢測(cè)培養(yǎng)基和發(fā)酵乳中的乳酸菌活菌數(shù)，每個(gè)樣本平行測(cè)定3次。
1.3.3 乳酸菌耐酸性測(cè)定
參照HUANG等[12]的方法并進(jìn)行微調(diào)。制備含8 g/L胃蛋白酶的無(wú)菌PBS并將其pH分別調(diào)至4.0、3.5、2.5、2.0、1.5。乳酸菌活化3代以上，以3%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量分別接種至不同pH梯度的酸性環(huán)境中37 ℃靜置培養(yǎng)3 h，測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，菌株存活率的計(jì)算如公式(3)所示。
(3)
式中：a，初始活菌數(shù)，CFU/mL；b，處理后活菌數(shù)，CFU/mL。
1.3.4 乳酸菌膽鹽耐受性測(cè)定
參照HUANG等[12]的方法并進(jìn)行微調(diào)。制備含1 g/L胰蛋白酶的無(wú)菌PBS(pH 8.0)，并分別添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的牛膽鹽。菌種活化3代以上，以3%接種量分別接種至不同膽鹽濃度的環(huán)境中37 ℃靜置培養(yǎng)4 h，按1.3.2的方法測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，菌株存活率的計(jì)算同1.3.3公式(3)。
1.3.5 乳酸菌表面疏水性測(cè)定
參照SADISHKUMAR等[13]的方法并進(jìn)行微調(diào)。將乳酸菌發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心3 min，棄去上清液，收集菌體沉淀。用無(wú)菌PBS(pH=7.4)洗滌菌體沉淀2次，重懸于無(wú)菌PBS中，調(diào)節(jié)菌發(fā)酵液的光密度值(OD600)為(0.8±0.05)。取2 mL菌發(fā)酵液與2 mL二甲苯混勻，室溫靜置30 min，分離兩相。吸取下層水相，在OD600下測(cè)定光密度值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，菌體表面疏水率(cell-surface hydrophobicity, CSH)的計(jì)算如公式(5)所示。
(5)
式中：A0，菌發(fā)酵液的吸光度；A1，下層水相的吸光度。
1.3.6 乳酸菌耐藥性測(cè)定
參照董春陽(yáng)[14]的方法并進(jìn)行微調(diào)。用生理鹽水調(diào)節(jié)乳酸菌MRS發(fā)酵液的光密度值(OD600)為(0.1±0.02)。將菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基表面，分區(qū)編號(hào)并將抗生素紙片(干燥)貼到涂布后的培養(yǎng)基表面，37 ℃下倒置培養(yǎng)24～48 h。用精確度為1 mm的直尺測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄。依據(jù)各類抗生素作用機(jī)制的不同，分別選取青霉素類的青霉素、頭孢類的頭孢唑啉、氨基糖苷類的慶大霉素、大環(huán)內(nèi)酯類的四環(huán)素、酰胺醇類的氯霉素、喹諾酮類的氧氟沙星這6種常見的抗生素。參照CLSI M100《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2017》，判讀菌株對(duì)抗生素的耐藥性。
2 結(jié)果與分析
2.1 具有降膽固醇能力乳酸菌的篩選及鑒定
從青海收集100多份自然發(fā)酵的牦牛乳(包括曲拉、發(fā)酵乳、發(fā)酵奶油、鮮牦牛乳)，從中分離出乳酸菌200株。臨床試驗(yàn)證明了L.rhamnosusgrx10(保藏編號(hào)為CGMCC No:2526)具有良好的降血脂能力[15]。篩選出21株菌，其體外膽固醇清除率均超過(guò)選定標(biāo)準(zhǔn)菌株L.rhamnosusgrx10(63.14%)，其中有6株菌的膽固醇清除率>70%。分析發(fā)現(xiàn)，YD-4膽固醇清除率顯著性(P<0.05)高于Q3-7及之后17株菌，G150～G050間的9株菌膽固醇清除率差異均不顯著(P>0.05)。對(duì)清除率較高的6株菌YD-4[(74.21%±1.58)%]、G150[(72.96±2.37)%]、Q2-3[(72.54±1.64)%]、G055[(71.96±1.22)%]、Q3-7[(70.69±2.09)%]、Q1-1[(70.475±1.14)%]進(jìn)行菌種鑒定。
將16S rDNA基因序列分析技術(shù)用于細(xì)菌的系統(tǒng)分類及鑒定，可以鑒定出篩選菌株與已知序列菌株之間的遠(yuǎn)近關(guān)系[16]。利用BLAST在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)篩選出的6株菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行檢索比對(duì)，對(duì)鑒定后的菌株重新命名，并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取9種已收錄的外源菌株基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如表2和圖1所示。
圖1 Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Construction of phylogenetic tree of strains by Neighbor-Joining method
由表2可知，LF-HF04與Lactobacillusfermentumstrain CIP 102980的同源性達(dá)到100%，LD-G150與Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus3286的序列相似度最高達(dá)到100%，LF-Q2-3與Lactobacillusfermentumstrain CIP 102980的同源性為99.93%，LB-G055與LactobacillusbuchneriCQ95-2-1-1-2的相似度為100%，LP-Q3-7與LactobacillusplantarumMG5355的序列相似度為100%，ST-Q1-1與Streptococussthermophilusstrain 3290的同源性為100%。這6株菌與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知乳酸菌的16S rDNA D1/D2區(qū)域序列高于99%的同源性，鑒定結(jié)果有效[17]。
因?yàn)楸狙芯康哪康臑楹Y選可食用益生菌菌株，根據(jù)《可用于食品的益生菌菌種名單》，Lactobacillusbuchneri-G055不在名單之內(nèi)，將其刪除，選擇剩余的5株菌株進(jìn)行進(jìn)一步的菌種性能實(shí)驗(yàn)。其中發(fā)酵乳桿菌LF-HF04的膽固醇降解率最高可達(dá)74.21%。
從圖1可知，所篩選菌株的親緣關(guān)系與BLAST序列比對(duì)結(jié)果一致，LP-Q2-3、LF-HF04均為發(fā)酵乳桿菌，LP-Q3-7為植物乳桿菌，LD-G150為保加利亞乳桿菌，ST-Q1-1為嗜熱鏈球菌。
2.2 篩選乳酸菌的性能研究
具有優(yōu)良性能的乳酸菌需要滿足實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)于乳酸菌生長(zhǎng)代謝特性多方面的需要，且適應(yīng)胃腸道的低pH環(huán)境、高滲透壓的膽鹽環(huán)境等特性是益生菌成功定植并發(fā)揮益生功能的前提[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)以菌株生長(zhǎng)能力、耐酸性、膽鹽耐受力、抗藥性及細(xì)胞表面疏水性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行潛在益生性能的篩選研究，并用凝乳試驗(yàn)初步判斷菌株的發(fā)酵能力，對(duì)從發(fā)酵乳制品中篩選能用于實(shí)際生產(chǎn)需要的具有降血脂功能的乳酸菌具有重要意義。
2.2.1 乳酸菌的生長(zhǎng)性能
篩選出的5株菌在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖2所示，5株乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性能良好，生長(zhǎng)曲線均為規(guī)則的S型曲線。在測(cè)定時(shí)間24 h內(nèi)經(jīng)歷了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。5種菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間相近，約為1.5 h；LF-HF04、LD-G150、Q1-1進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間約為7.5 h，LF-Q2-3、LP-Q3-7進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間約為8.5 h；4株菌株在穩(wěn)定期均持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。進(jìn)入穩(wěn)定期后可達(dá)到的最大活菌量：LF-HF04>LF-Q2-3>LP-Q3-7>LD-G150>ST-Q1-1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得LF-HF04在24 h時(shí)的活菌數(shù)可達(dá)7.22×108CFU/mL。
圖2 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of lactic acid bacteria
2.2.2 乳酸菌的發(fā)酵性能
產(chǎn)酸能力是乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的重要性能，乳酸菌產(chǎn)酸的快慢影響酸奶的組織結(jié)構(gòu)和品質(zhì)[19]。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中對(duì)發(fā)酵乳的酸度要求(>70 °T)，將篩選出的5株乳酸菌在巴氏殺菌牛乳中發(fā)酵，測(cè)定酸度達(dá)到70 °T所用時(shí)間，結(jié)果如圖3所示。
圖3 乳酸菌的產(chǎn)酸性能Fig.3 Acid production performance of lactic acid bacteria
根據(jù)圖3可知，2株發(fā)酵乳桿菌LF-HF04和LF-Q2-3的發(fā)酵性能最好，分別在11.5 和13.5 h時(shí)可使發(fā)酵乳的酸度達(dá)到70 °T。有研究表明，發(fā)酵乳桿菌為發(fā)酵乳制品中的優(yōu)勢(shì)菌株，具有良好的發(fā)酵能力[20-21]。其余3株乳酸菌均需要20 h左右其發(fā)酵乳酸度才能達(dá)到70 °T，植物乳桿菌LP-Q3-7的發(fā)酵乳在24.5 h酸度達(dá)到70 °T,所用時(shí)間最長(zhǎng)。這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌為植物源乳酸菌，在乳基中的生長(zhǎng)性能和產(chǎn)酸能力較差，使得發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)[22]。由于這5株乳酸菌的單菌發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，工廠生產(chǎn)時(shí)成本較高，且易造成產(chǎn)品污染，在實(shí)際運(yùn)用時(shí)需要采用商業(yè)菌種混合發(fā)酵，以滿足生產(chǎn)中對(duì)活菌總數(shù)和發(fā)酵周期等的需求。
2.2.3 菌株的耐酸和膽鹽耐受能力
益生菌作為正常腸道菌群的一員，在攝入后從口腔到腸道傳送的過(guò)程中，必須克服口腔、胃部(高酸性、胃蛋白酶)和消化道上端(膽鹽、胰酶)等部位的不良環(huán)境，才能對(duì)宿主發(fā)揮有益功效。因此，良好的人體胃腸道環(huán)境抗逆能力已經(jīng)成為評(píng)價(jià)益生菌的重要性質(zhì)和指標(biāo)，在一定程度上反映乳酸菌在真實(shí)胃腸道環(huán)境中的實(shí)際存活能力。同時(shí)多數(shù)研究表明，在膽鹽存在的條件下，乳酸菌才能更好地吸收膽固醇，所以篩選的降膽固醇乳酸菌必須具有對(duì)膽鹽的耐受性[23]。
5株菌分別在pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0的環(huán)境中處理3 h的生長(zhǎng)和存活情況如圖4-a所示，牛膽鹽濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的環(huán)境中處理4 h后的生長(zhǎng)和存活狀況，耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-b所示。
a-耐酸性；b-膽鹽耐受性圖4 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力Fig.4 Acid and bile salt tolerance of lactic acid bacteria
從圖4-a中可知，在pH<2.0時(shí)，所有菌株均不能存活，在pH為2.0～4.0時(shí)，菌株存活率與環(huán)境pH的增加呈正相關(guān)。在pH 4.0的環(huán)境中處理3 h后，5株菌存活率均大于70%，LF-HF04的存活率最高為97.65%，顯著高于其他4株菌(P<0.05)。在pH 2.5時(shí)，LD-G150和LP-Q3-7的存活率下降至低于20%，其他3株均保持在45%以上的存活率，LF-Q2-3存活率最高為56.28%，顯著高于其他4株菌(P<0.05)。
從圖4-b可知，乳酸菌的存活率與環(huán)境中膽鹽含量呈負(fù)相關(guān)。1 g/L的膽鹽處理4 h后，LF-HF04、LD-G150及LF-Q2-3的存活率在90%以上，LP-Q3-7的存活率最低為64.84%。相較于其他4株乳酸菌，LP-Q3-7對(duì)膽鹽的耐受性最差，整體存活率最低，在含有3 g/L牛膽鹽的人工腸液中處理4 h后，存活率已降到了28.38%，其他4株菌的存活率均保持在50%以上。在膽鹽5 g/L時(shí)，5株乳酸菌均表現(xiàn)出不同程度的耐受性：LF-HF04(53%)>ST-Q1-1(42.27%)>LF-Q2-3(28.18%)>LD-G150(18.67%)>LP-Q3-7(17.03%)，LF-HF04、ST-Q1-1、LF-Q2-3差異顯著(P<0.05)，LD-G150和LP-Q3-7差異不顯著(P>0.05)。
正常人的胃液pH 1.5～4.5，其pH值因食物結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)。通常人體胃液pH≈3.0，空腹和食用酸性食品可達(dá)1.5，食用堿性食物可達(dá)4～5，且食物(尤其是流體)通過(guò)胃的時(shí)間相對(duì)較短，一般1～2 h[24]。LF-Q2-3、LF-HF04和ST-Q1-1具備相對(duì)好的耐酸性，能夠保證在進(jìn)食非酸性食品時(shí)，有一定數(shù)量的活菌體順利通過(guò)胃酸環(huán)境到達(dá)腸道內(nèi)。通過(guò)胃液后存活的菌株將在小腸的上部遇到膽鹽，故對(duì)膽鹽具有抗性是它能夠在腸道中生長(zhǎng)、存活、發(fā)揮功效的一個(gè)重要指標(biāo)[25]。MARTEAU等[26]認(rèn)為人體內(nèi)正常的膽鹽濃度為0.3%～0.5%，同時(shí)食物通過(guò)腸道的時(shí)間一般為4～16 h。LF-HF04、LF-Q2-3、LD-G150和ST-Q1-1均具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。綜合而言，LF-HF04菌株對(duì)酸性環(huán)境和膽鹽具有良好的耐受性，預(yù)測(cè)在實(shí)際胃和腸道上端環(huán)境中能順利通過(guò)并存活下來(lái)。
2.2.4 乳酸菌表面疏水性
乳酸菌在胃腸道中的黏附和定植是其在人體內(nèi)表現(xiàn)益生功效的先決條件。有研究證明細(xì)菌表面疏水性與其對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附力存在一定的正相關(guān)性[27-28]。菌體表面疏水性是影響乳酸菌黏附性的內(nèi)在因素，被廣泛地作為評(píng)價(jià)乳酸菌黏附性能的重要指標(biāo)。采用碳烴化合物粘著法測(cè)定不同菌株的疏水性差異，5株菌的表面疏水性如圖5所示。
圖5 乳酸菌的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of lactic acid bacteria
當(dāng)CSH>50%時(shí)為高度疏水，當(dāng)20%
2.2.5 對(duì)抗生素的耐藥性
乳酸菌的耐藥性大致可分為2種，即天然性耐藥和獲得性耐藥。大多數(shù)乳酸菌對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類、糖肽類以及磺胺類等抗生素具有天然耐藥性，天然性耐藥基因很少傳播。然而，由于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中抗生素的濫用導(dǎo)致獲得性耐藥基因在細(xì)菌中出現(xiàn)并傳播，乳酸菌中的獲得性耐藥基因可能會(huì)轉(zhuǎn)移到人體胃腸道的微生物菌群甚至是致病菌中，存在潛在安全隱患[29-30]。因此，篩查乳酸菌的抗生素耐藥性并評(píng)估其安全性具有重要意義。
本實(shí)驗(yàn)從6類常用抗生素中分別選擇了具有代表性的6種抗生素，對(duì)所篩選的5株乳酸菌進(jìn)行了紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，以期為篩選出的乳酸菌被用于功能性食品生產(chǎn)的安全性提供理論依據(jù)。由表3可知，ST-Q1-1對(duì)多種抗生素具有耐藥性，其余4株菌對(duì)絕大多數(shù)抗生素敏感。分析認(rèn)為ST-Q1-1多重耐藥性的原因：一方面，可能是抗生素的濫用導(dǎo)致生牛乳中抗生素的殘留，使乳酸菌從外界獲得耐藥基因；另一方面可能是由于抗生素的選擇性壓力，使乳酸菌發(fā)生基因突變產(chǎn)生耐藥基因。所有受試菌株均對(duì)慶大霉素敏感，這可能與慶大霉素能很好地通過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜有關(guān)[31-32]。有3株菌對(duì)氧氟沙星耐藥，研究指出乳酸菌對(duì)氟哇諾酮類抗生素有天然耐藥性[33]。LF-HF04的抑菌圈直徑整體上大于另外4株受試菌，且對(duì)這6種抗生素均表現(xiàn)為敏感，初步判斷其不具有可傳播的耐藥基因。
表3 抑菌圈直徑及抗性結(jié)果 單位：mm
3 結(jié)論與討論
本研究從青海發(fā)酵牦牛乳中篩選出200株乳酸菌，有21株菌株膽固醇清除率高于選定標(biāo)準(zhǔn)菌株grx10(63.14%)，其中LF-HF04的膽固醇清除率最高(74.21%)。所篩5株菌株生長(zhǎng)性能良好，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，菌體濃度均穩(wěn)定在108CFU/mL；使發(fā)酵乳的酸度達(dá)到70 °T所用時(shí)間范圍為11.5～24.5 h，其中LF-HF04和LF-Q2-3在乳中的產(chǎn)酸性能更好，分別在發(fā)酵11.5和13.5 h時(shí)酸度達(dá)到70 °T。5株菌株在pH為3.0的環(huán)境下處理3 h均能存活，說(shuō)明這5株菌能在進(jìn)食非酸性食品時(shí)通過(guò)胃液進(jìn)入小腸，其中LF-HF04和LF-Q2-3的耐酸性更好；5株菌株在3.0～5.0 g/L膽鹽下處理4 h后均能存活，且活菌數(shù)均達(dá)到106CFU/mL，說(shuō)明5株菌株能夠通過(guò)小腸存活下來(lái)，其中LF-HF04和ST-Q1-1對(duì)膽鹽的耐受性更強(qiáng)。5株菌株的表面疏水性范圍在5.09%～42.01%，菌株LF-Q2-3和LF-HF04疏水性較強(qiáng)，分別為42.01%和30.37%。5株菌株中ST-Q1-1具有多重耐藥性，LF-HF04的抑菌圈直徑整體上大于另外4株受試菌，且對(duì)6類常用抗生素敏感，初步判斷其安全性較好。
綜上所述，發(fā)酵乳桿菌LF-HF04的各項(xiàng)性能優(yōu)良，可作為開發(fā)降膽固醇功能性乳制品和微生態(tài)制劑的潛力菌株，有廣闊的應(yīng)用前景。
