大腸桿菌羊毛甾醇合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化

胡苗苗，陸震鳴，羅志珊，李心陽，徐國強(qiáng)，李會，史勁松，許正宏*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

三萜類化合物是以環(huán)戊烷駢多氫菲為母核的天然產(chǎn)物，廣泛分布于自然界中，不僅是維持宿主自身生命活動的必需物，還是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來源。三萜結(jié)構(gòu)的多樣性決定了其豐富的藥理活性，如保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)等[1-5]。

三萜類化合物在植物或真菌中的天然產(chǎn)量極低，且非模式生物遺傳操作體系的不成熟導(dǎo)致原生宿主的代謝改造較為困難，無法從天然原料中獲得足量三萜滿足市場需求，其復(fù)雜多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)又導(dǎo)致化學(xué)合成法難以推動，阻礙了三萜類化合物的深入研究與廣泛應(yīng)用[6]。因此，在易操作的異源宿主中進(jìn)行生物合成是實現(xiàn)三萜類化合物高效生產(chǎn)的一個有吸引力的策略。大腸桿菌作為表達(dá)宿主的應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，具有遺傳背景清晰、遺傳操作簡單、生長迅速、成本低、易于控制和大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點，此外大腸桿菌中萜烯合成途徑簡單線性，基本不分流三萜前體[7]，已被用作多種三萜類化合物合成的細(xì)胞工廠，如達(dá)瑪烯二醇-Ⅱ[8]、龍涎香醇[9]、β-香樹脂醇和環(huán)阿屯醇[10]等。

大腸桿菌中的甲基赤蘚糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythrito-4-phosphate，MEP)途徑可以為三萜類化合物的合成提供前體法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)，F(xiàn)PP可經(jīng)鯊烯合酶(squalene synthase，SQS)和鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase，SE)催化生成2,3-環(huán)氧角鯊烯，在不同的氧化鯊烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyclase, OSCs)作用下環(huán)化形成各種類型的骨架。羊毛甾醇是主要的三萜骨架，可以通過一系列細(xì)胞色素P450的官能化修飾衍生為羊毛甾烷型、麥角甾烷型、膽甾烷型等類型的三萜及甾體類化合物[11]。目前已有在大腸桿菌中合成角鯊烯和2,3-環(huán)氧角鯊烯的研究，KATABAMI等[12]通過在大腸桿菌中表達(dá)人源SQS實現(xiàn)了角鯊烯的合成，LI等[8]和邵喜喜等[13]將酵母SQS分別與來源于莢膜甲基球菌和大鼠的SE共表達(dá)，在大腸桿菌中實現(xiàn)了2,3-環(huán)氧角鯊烯的合成。然而尚未有大腸桿菌合成羊毛甾醇的報道，本研究設(shè)想在大腸桿菌中構(gòu)建并優(yōu)化三萜骨架羊毛甾醇合成途徑，為三萜類化合物的異源生物合成提供參考與借鑒(圖1)。

圖1 大腸桿菌工程菌中羊毛甾醇合成途徑的構(gòu)建Fig.1 Biosynthetic pathway of lanosterol in the engineered E.coli

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要材料與試劑

質(zhì)粒pET28a(+)、pCDF-DUET-1，大腸桿菌菌株JM109、BL21(DE3)，釀酒酵母菌株W303-1a均為實驗室保存；莢膜甲基球菌鯊烯環(huán)氧酶McSE和氧化鯊烯環(huán)化酶McOSC的基因，蘇州金唯智生物科技有限公司。

硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate, Kan)、硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate, Str)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，上海生工生物工程有限公司；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技股份有限公司， 2,3-環(huán)氧角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司，羊毛甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，瓊脂20。

TB培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO42.31，K2HPO412.54，胰蛋白胨 12，酵母提取物24，甘油4，pH值7.5。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

C1000型PCR儀、164-5070型核酸電泳儀，美國Bio-Rad公司；5200Multi型凝膠成像系統(tǒng)，上海Tanon科技有限公司；5424型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；UV-1600型紫外分光光度計，美國Thermo Science公司；JY92-IIN型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Pegasus BT氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀，美國Leco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

改造pET28a(+)載體，在NotI和XhoI位點之間再插入1個T7啟動子區(qū)域，得到改造后的雙T7啟動子載體，命名為pET28T。以釀酒酵母W303-1a基因組為模板克隆截短的鯊烯合酶基因Scsqs，并在5′端引入RBS結(jié)合位點，插入pET28T載體的XbaI和BamHI位點之間，構(gòu)建了質(zhì)粒pET28T-tSS。莢膜甲基球菌鯊烯環(huán)氧酶基因Mcse經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后合成，亞克隆至pET28T-tSS的BamHI和SacI位點之間，構(gòu)建了質(zhì)粒pET28T-tSSE。

在pCDF-DUET-1載體的BamHI和EcoRI位點之間引入促溶標(biāo)簽TrxA，改造后的載體命名為pDX。莢膜甲基球菌氧化鯊烯環(huán)化酶基因Mcosc經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后合成至pDX的SacI和NotI位點之間，構(gòu)建了質(zhì)粒pDXOSC。

從大腸桿菌基因組克隆了MEP途徑關(guān)鍵酶基因1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs、法尼基焦磷酸合酶基因ispA、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因idi，分別插入pET28T-tSSE的KpnI和XhoI位點之間，構(gòu)建了質(zhì)粒pET28T-tSSED、pET28T-tSSEA、pET28T-tSSEI。通過融合PCR將dxs和ispA擴(kuò)增為dxs-ispA融合片段，插入pET28T-tSSE的KpnI和XhoI位點之間，構(gòu)建了質(zhì)粒pET28T-tSSEDA，本研究使用的引物見表1，所構(gòu)建的質(zhì)粒和菌株見表2。

1.2.2 菌株與培養(yǎng)條件

大腸桿菌JM109作為克隆菌株，BL21(DE3)作為蛋白表達(dá)和產(chǎn)物合成的宿主菌。將構(gòu)建的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入JM109中，涂布于在LB固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。通過菌落PCR和測序驗證篩選重組菌株，挑取驗證正確的單克隆于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min過夜培養(yǎng)，然后將發(fā)酵液以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到50 mL的TB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)2～3 h。當(dāng)OD600達(dá)0.6～0.8時，添加終濃度為0.3 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，20 ℃誘導(dǎo)48 h。培養(yǎng)基中根據(jù)需要添加抗生素(終質(zhì)量濃度均為50 mg/L的硫酸卡那霉素和/或鏈霉素)。測序工作均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2.3 產(chǎn)物的提取與測定

取20 mL發(fā)酵液，4 ℃，8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入10 mL超純水渦旋打散，4 ℃，8 000 r/min離心5 min，棄凈上清液，再用5 mL丙酮重懸菌體，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎萃取羊毛甾醇，設(shè)定為超聲波破碎功率300 W，工作10 s，間歇10 s，共超聲波處理20 min。將萃取液于8 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 mm有機(jī)濾膜過濾，-20 ℃靜置過夜后12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至潔凈離心管內(nèi)，用N2流吹干，再加入2 mL丙酮復(fù)溶管壁殘余物質(zhì)。

表2 本研究構(gòu)建的質(zhì)粒與菌株Table 2 Plasmids and strains constructed in this study

通過HPLC檢測角鯊烯和2,3-環(huán)氧角鯊烯。色譜柱：Waters C18柱；色譜條件：柱溫30 ℃，流動相為V(乙腈)∶V(甲醇)=6∶4，流速1 mL/min，紫外檢測波長為203 nm，進(jìn)樣體積20 mL，等度洗脫。通過GC-MS檢測羊毛甾醇，檢測條件參考LI等[14]的研究。

1.2.4 工程菌株生產(chǎn)羊毛甾醇的發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵條件對菌株生長和產(chǎn)物積累影響重大，本文從pH、IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度3個因素進(jìn)行研究，得出重組菌株的最適發(fā)酵條件。以BT-tSSEDA-DXOSC作為待試菌株，以胞內(nèi)羊毛甾醇的產(chǎn)量為指標(biāo)，在TB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗設(shè)計：在誘導(dǎo)溫度為20 ℃，IPTG濃度為0.3 mmol/L的條件下，設(shè)置各實驗組初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；在初始pH為7.5，IPTG濃度為0.3 mmol/L的條件下，設(shè)置誘導(dǎo)溫度分別為16、20、25、30、37 ℃；在初始pH為7.5，誘導(dǎo)溫度20 ℃的條件下，設(shè)置IPTG終濃度分別為0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，各因素選取3個最佳水平進(jìn)行正交試驗，確定重組菌株生產(chǎn)羊毛甾醇的最佳發(fā)酵條件組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌角鯊烯及2,3-環(huán)氧角鯊烯合成途徑的構(gòu)建

將質(zhì)粒pET28T-tSS轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主BL21 (DE3)中，生成重組菌株BT-tSS，同時將僅含空質(zhì)粒pET28T的菌株BT作為對照組(表2)。所構(gòu)建的工程菌株發(fā)酵48 h后用丙酮提取胞內(nèi)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。HPLC結(jié)果顯示，菌株BT-tSS在22.3 min處出現(xiàn)角鯊烯特征峰，表明角鯊烯合成模塊的成功構(gòu)建(圖2)。

a-角鯊烯合成模塊示意圖；b-2,3-環(huán)氧角鯊烯合成模塊示意；c-工程菌株丙酮提取物的HPLC檢測圖2 角鯊烯與2,3-環(huán)氧角鯊烯合成模塊的構(gòu)建與HPLC檢測Fig.2 Construction of squalene and 2,3-oxidosqualene biosynthesis module and the HPLC analysis.

在此基礎(chǔ)上向大腸桿菌中引入McSE，得到菌株BT-tSSE。HPLC結(jié)果顯示菌株BT-tSSE在13.6 min處出現(xiàn)了2,3-環(huán)氧角鯊烯的特征峰，表明2,3-環(huán)氧角鯊烯合成模塊的成功構(gòu)建。

2.2 大腸桿菌羊毛甾醇合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化

真核生物來源的OSC為膜結(jié)合蛋白，不適配于無細(xì)胞器膜的大腸桿菌表達(dá)體系。LAMB等[15]在原核生物莢膜甲基球菌中發(fā)現(xiàn)了與真核生物OSC同源的McOSC，在莢膜甲基球菌中表達(dá)為可溶形式。NAKANO等[16]在大腸桿菌中異源表達(dá)了McOSC，其純酶能以2,3-環(huán)氧角鯊烯為底物生成羊毛甾醇。本研究將McOSC經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后合成至載體pDX上得到質(zhì)粒pDXOSC，再與質(zhì)粒pET28T-tSSE共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)中，獲得重組菌株BT-tSSE-DXOSC。將轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pET28T和pDX的菌株BTD作為對照組，所得菌株發(fā)酵48 h后用丙酮提取胞內(nèi)產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果顯示在工程菌BT-tSSE-DXOSC在16.8 min處出現(xiàn)了羊毛甾醇特征峰，表明羊毛甾醇合成模塊的成功構(gòu)建(圖3)。

a-羊毛甾醇合成模塊示意圖；b-工程菌株丙酮提取物的GC-MS檢測圖3 羊毛甾醇合成模塊的構(gòu)建與GC-MS檢測Fig.3 Construction of lanosterol biosynthesis module and the GC-MS analysis.

雖然BT-tSSE-DXOSC已有羊毛甾醇生成，但產(chǎn)量僅0.77 mg/L，因此需要對該菌株的羊毛甾醇合成途徑進(jìn)行優(yōu)化。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)和法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS)是三萜類化合物合成的關(guān)鍵限速酶，DXS催化MEP途徑的第一步反應(yīng)，F(xiàn)PS催化萜類共同前體FPP的生成[17-18]；異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)催化異戊烯焦磷酸與烯丙基焦磷酸的相互轉(zhuǎn)化，決定二者的配比，從而影響下游產(chǎn)物的合成[19]，以上3種途徑酶均為代謝改造的重要靶點。目前已有許多研究通過過表達(dá)上述關(guān)鍵酶使得萜類物質(zhì)的產(chǎn)量顯著提高[18,20-21]。

本研究在BT-tSSE-DXOSC的基礎(chǔ)上分別單獨過表達(dá)了MEP途徑關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs、法尼基焦磷酸合酶基因ispA和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因idi，得到菌株BT-tSSED-DXOSC、BT-tSSEA-DXOSC和BT-tSSEI-DXOSC。上述3株工程菌株在pH值7.5，0.3 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)溫度20 ℃的條件下的羊毛甾醇產(chǎn)量分別為1.86、1.62和1.50 mg/L，較BT-tSSE-DXOSC各提高了1.4、1.3和1倍。對比可知dxs和ispA過表達(dá)對羊毛甾醇生產(chǎn)的促進(jìn)作用較idi更為明顯，因此我們構(gòu)建了dxs-ispA融合過表達(dá)菌株BT-tSSEDA-DXOSC，該菌株的羊毛甾醇產(chǎn)量為2.39 mg/L，較BT-tSSE-DXOSC提高了2.1倍(圖4)。

圖4 工程菌株羊毛甾醇產(chǎn)量對比Fig.4 Lanosterol production of different engineered strains

2.3 pH、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度對羊毛甾醇產(chǎn)量的影響

隨著pH增大，菌體干重和羊毛甾醇產(chǎn)量的變化趨勢一致，均為先升高后降低，在pH為7.5時達(dá)到最大值，表明pH通過影響菌體生長從而影響羊毛甾醇的生產(chǎn)(圖5-a)。隨著IPTG濃度增大，菌體干重逐漸降低，羊毛甾醇產(chǎn)量則先升高后降低，IPTG濃度為0.5 mmol/L時達(dá)羊毛甾醇產(chǎn)量最高，這是由于IPTG在促進(jìn)蛋白表達(dá)的同時對菌體有一定的毒害作用，且IPTG濃度較高時，蛋白合成速度過快，錯誤折疊率上升，從而影響了羊毛甾醇的生成(圖5-b)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度分別為16、20、25、30、37 ℃時，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，菌體干重呈升高趨勢，羊毛甾醇產(chǎn)量先升后降，在30 ℃時達(dá)到最大值，這是由于37 ℃最適宜大腸桿菌菌體生長，而稍低的溫度則更有利于酶蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)物生成(圖5-c)。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，各因素選擇產(chǎn)量最高的3個水平設(shè)計正交試驗，每組試驗重復(fù)3次。使用Minitab軟件進(jìn)行正交試驗極差分析(表3)和方差分析(表4)。由方差分析可知，pH、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度對羊毛甾醇產(chǎn)量均有顯著影響(P<0.05)。由極差R值可得，3個因子對羊毛甾醇產(chǎn)量影響的主次順序為誘導(dǎo)溫度(C)>pH(A)>IPTG濃度(B)。根據(jù)均值k值得出各因素的最優(yōu)水平組合，即A2B2C3。

a-pH；b-IPTG濃度；c-誘導(dǎo)溫度圖5 pH、IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度對菌株BT-tSSEDA-DXOSC羊毛甾醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of pH, IPTG concentration and inducing temperature on lanosterol production of strain BT-tSSEDA-DXOSC

表3 大腸桿菌工程菌株發(fā)酵條件的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 The design and results of the orthogonal experiment for fermentation condition to engineered E.coli

表4 正交試驗方差分析Table 4 The variance results of the orthogonal experiment

由于表中已有最優(yōu)組合A2B2C3，且試驗結(jié)果與分析結(jié)果一致，因此可以得出重組菌株生產(chǎn)羊毛甾醇的最佳發(fā)酵條件為pH 7.5，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度30 ℃，此時羊毛甾醇產(chǎn)量為5.12 mg/L，較優(yōu)化前提高了1.14倍。

3 結(jié)論

本研究通過在大腸桿菌中共表達(dá)ScSQS、McSE和McOSC，構(gòu)建了羊毛甾醇合成途徑，工程菌株BT-tSSE-DXOSC產(chǎn)生了0.77 mg/L的羊毛甾醇。為提高羊毛甾醇的產(chǎn)量，分別單獨過表達(dá)了MEP途徑關(guān)鍵限速酶DXS、FPS和IDI，對比發(fā)現(xiàn)DXS和FPS對羊毛甾醇產(chǎn)量的促進(jìn)效果優(yōu)于IDI。因此構(gòu)建了DXS和FPS的融合過表達(dá)菌株BT-tSSEDA-DXOSC，羊毛甾醇產(chǎn)量為2.39 mg/L，較BT-tSSE-DXOSC提高了2.1倍。同時對pH、IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了單因素優(yōu)化，并通過正交試驗確定了最佳發(fā)酵條件：pH 7.5，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度30 ℃，該條件下BT-tSSEDA-DXOSC的羊毛甾醇產(chǎn)量為5.12 mg/L，較初始條件提高了1.1倍。本研究成功構(gòu)建產(chǎn)羊毛甾醇的雙質(zhì)粒重組大腸桿菌，為羊毛甾醇下游代謝途徑酶功能的研究及三萜類化合物的合成提供有效工具，同時為利用原核生物異源合成羊毛甾醇為骨架的三萜類化合物奠定基礎(chǔ)。