木葡糖酸醋桿菌發酵黃酒糟酶解液產細菌纖維素的研究

魯瑞剛，陸進舟，朱佳蓮，周 牽，陸筑鳳，李加友

（1.浙江嘉善黃酒股份有限公司，浙江 嘉興 314100；2.嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由醋酸菌屬（Acetobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和八疊球菌屬（Sarcina）等微生物在不同條件下合成的纖維素統稱[1]。細菌纖維素不含木質素、果膠和半纖維素等伴生產物，具有高結晶度和高聚合度，擁有納米級的超精細網狀結構（因此又稱為細菌納米纖維素），具備良好的彈性、聚合性、延展性、可降解性[2-3]。目前，細菌纖維素廣泛應用于食品、化妝品、醫用敷料、人工角膜和復合材料等領域[4-8]，被譽為21世紀最具發展前景的生物材料[9-10]。

目前，國內外對細菌納米纖維素相關方面的研究開展了大量工作，如高產菌株選育、發酵工藝條件優化、操作方式和代謝機理等[11-13]。但是，制約細菌纖維素產業發展的主要原因是生產成本過高，其關鍵之處在于發酵效率較低和生產原料成本過高。因此，利用廢棄物如酒糟浸出液、黃水等生產細菌纖維素一方面可以降低生產成本，另一方面實現了廢棄物的資源化利用[14-16]。GAYATHRI G等[17]利用篩選獲得的Komagataeibacter saccharivorans發酵廢棄酒糟，細菌纖維素產量為1.24 g/L；張沙沙等[18]利用木薯水解液為發酵培養基，將細菌纖維素的產量提高到5.75 g/L，但是單位體積產量仍然不能滿足工業化生產需要。王英男等[19]以乳清液為發酵基質生產細菌纖維素，實現了產量的顯著提升，但是原料成本過高，且資源局限。另一方面，我國釀酒工業發達，廢棄酒糟產量巨大，酒糟中殘留的淀粉、蛋白質和氨基酸豐富，具有開發為細菌纖維素生產原料的潛力。賀富強等[20]用白酒糟酶解液作為促進劑添加到細菌纖維素的基礎培養基中，研究表明，酒糟中含有促進細菌纖維素產量提升的活性因子，細菌纖維素產量為4.84 g/L，較對照提升了135.3%。馬霞等[21]采用響應面試驗設計優化了細菌纖維素的發酵條件，并添加黃酒酒糟浸出液，在發酵溫度30 ℃的條件下，培養7 d后的細菌纖維素產量為14.44 g/L，較優化前提高了1.5倍。

在研究文獻和前期工作的基礎上，認為利用自有的高性能細菌纖維素生產菌株，可以將黃酒酒糟酶解液作為基礎培養基，并充分發揮酒糟中活性因子的促進作用，只需添加部分營養物，實現細菌纖維素的高產，降低原料成本。因此，本研究將通過對黃酒酒糟酶解液發酵生產細菌纖維素的工藝條件進行系統優化，以期為細菌纖維素的低成本高產發酵開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

新鮮黃酒酒糟：浙江嘉善黃酒股份有限公司；紅茶（金駿眉900）：福建南平市一杯香茶葉有限公司；木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）BC19-2：本實驗室馴化，菌體濃度為108個/mL，4 ℃保存備用。

1.1.2 試劑

蔗糖：云南滇鵬糖業有限公司；葡萄糖、檸檬酸、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨：杭州微生物試劑有限公司；無水乙醇、乙酸：江蘇強盛功能化學股份有限公司；葡糖淀粉酶（酶活260 000 U/mL）：滄州夏盛酶生物技術有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

細菌纖維素發酵初始培養基：蔗糖10 g，紅茶2 g，水100 mL，pH 5.0。煮沸后采用三層紗布過濾后取上清液，冷卻至室溫。

1.2 儀器與設備

BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；THZ-92B臺式恒溫培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；WB-6數顯恒溫水浴鍋：常州邁諾儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒糟酶解液的制備

將新鮮的黃酒酒糟用攪拌器打碎，按照酒糟干質量加入3倍質量的水，然后加入總體積0.5%的葡糖淀粉酶（酶活260 000 U/mL），充分攪拌均勻，在酶解溫度60 ℃條件下酶解3 h后用紗布過濾制得酒糟酶解液，備用。

1.3.2 細菌纖維素的發酵制備

于配制好的細菌纖維素發酵初始培養基中接種6%實驗室保存的木葡糖酸醋桿菌BC19-2，25 ℃恒溫靜置培養5 d，待培養液表面長出細菌纖維素膜，定期稱量并計算細菌纖維素的產量。

1.3.3 細菌纖維素的制備條件優化單因素試驗

家庭也有用缸貯藏番茄的，其方法是將缸沖刷干凈，然后把選好的番茄裝入缸內，裝缸時以3～4個果高為一層，每層之間要設支架隔離以防擠壓損傷，裝滿后用塑料薄膜封缸口，15～20天打開檢查一次，迅速挑出爛果實，然后重新裝缸密封，繼續貯藏。

分別考察不同培養基組成的碳源（2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖、葡萄糖、新鮮黃酒酒糟酶解液），氮源（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的復合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶1）、硝酸銨及1 g/100 mL、1.5 g/100 mL、2 g/100 mL、2.5 g/100 mL、3 g/100 mL的紅茶）；初始pH（3、4、5、6、7）、培養溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）；黃酒酒糟酶解液酶解時間（0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、酶解液體積分數（10%、30%、50%、70%、90%）對細菌纖維素產量的影響。

1.3.4 測定方法

采用稱質量法（濕質量）測定細菌纖維素產量：取出纖維素膜，沖洗干凈；而用酒糟酶解液發酵而成的細菌纖維素膜背面會殘留一層酒糟渣顆粒，需用手輕輕搓洗干凈，之后置于紗布上方瀝干20 min后稱質量[22]。

1.3.5 細菌纖維素膜的表征

參考張雯等[23]的方法并做適當的修改：將發酵完成后所得到的細菌纖維素膜清洗干凈之后，浸泡于0.1 mol/L的NaOH中，置于燒杯內在水浴鍋中90 ℃水浴加熱。反復換堿液若干次直至纖維素膜呈半透明狀。將膜取出用蒸餾水洗凈，放入冰箱-18 ℃預凍至定型，進行真空冷凍干燥，制得凍干的細菌纖維素膜。參照文獻[22]進行電鏡檢測。

2 結果與分析

2.1 培養基組成對細菌纖維素產量的影響

2.1.1 碳源對細菌纖維素產量的影響

由圖1可知，隨著碳源添加量的增加，細菌纖維素的產量也均有所增加，但在添加量達到6%之后，細菌纖維素的產量趨于平穩。由此可以看出，在碳源濃度較低時，隨著碳源添加量的增加，木葡糖酸醋桿菌生長更快，細菌纖維素產量越高；另一方面，3種碳源中以酒糟酶解液為碳源時細菌纖維素產量最大（24.8 g/L），以蔗糖為碳源時產量最小。基于對細菌纖維素發酵初始培養基的比較，進一步考察了3種碳源添加量均為10%時細菌纖維素的發酵能力，酒糟酶解液產細菌纖維素能力最強（24.6 g/L），葡萄糖次之（23.2 g/L），蔗糖最低（20.8 g/L），因此，最佳碳源為酒糟酶解液，最佳添加量為6%。

圖1 不同碳源添加量對細菌纖維素產量的影響Fig.1 Effect of different carbon source addition on bacterial cellulose yield

2.1.2 氮源對細菌纖維素產量的影響

圖2 不同氮源添加量對細菌纖維素產量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen source addition on bacterial cellulose yield

2.2 培養條件對細菌纖維素產量的影響

2.2.1 初始pH值對細菌纖維素產量的影響

由圖3可知，細菌纖維素產量在培養基初始pH值為6時達到最高。木葡糖酸醋桿菌是醋酸菌屬，喜好偏弱酸性的環境，太高或太低的pH值都會對菌種的生長與產細菌纖維素能力產生負面影響[24]。因此，最佳初始pH值為6。

圖3 初始pH值對細菌纖維素產量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on bacterial cellulose yield

2.2.2 培養溫度對細菌纖維素產量的影響

由圖4可知，隨著培養溫度的升高，細菌纖維素的產量增高，在30 ℃時達到峰值；溫度繼續升高時，細菌纖維素產量則會減少；培養溫度達到40 ℃時，木葡糖酸醋桿菌便不再產細菌纖維素。由此可見，低溫時木葡糖酸醋桿菌生長緩慢，細菌纖維素形成耗時長，而溫度過高則會導致木葡糖酸醋桿菌休眠或死亡，無法產生細菌纖維素[25]。因此，最佳培養溫度為30 ℃。

圖4 培養溫度對細菌纖維素產量的影響Fig.4 Effect of culture temperature on bacterial cellulose yield

2.2.3 接種量對細菌纖維素產量的影響

由圖5可知，隨著菌液接種量增加，細菌纖維素產量也隨之增加，當接種量達6%后，細菌纖維素產量達到峰值；繼續增加接種量，細菌纖維素產量隨之減少。接種量過大將不利于細菌生長，還易引起發酵過程中溶氧不足的問題，影響產物細菌纖維素合成；接種量過小時木葡糖酸醋桿菌生長緩慢，培養時間過長，產物細菌纖維素生產效率低。因此，最佳接種量為6%。

圖5 接種量對細菌纖維素產量的影響Fig.5 Effect of inoculum on bacterial cellulose yield

2.3 酒糟酶解條件對細菌纖維素產量的影響

2.3.1 酶解時間對細菌纖維素產量的影響

由圖6可知，在酒糟酶解過程中，隨酶解時間增加，細菌纖維素產量增加，在酶解3 h時達到峰值；酶解時間超過3 h之后，細菌纖維素的產量稍有減小。因此，黃酒糟酶解處理的最佳酶解時間為3 h。

圖6 酶解時間對細菌纖維素產量的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on bacterial cellulose yield

2.3.2 酒糟酶解液體積分數對細菌纖維素產量的影響

由圖7可知，當酒糟酶解液體積分數為10%時，細菌纖維素產量極低；酒糟酶解液體積分數30%后有明顯提高，酒糟酶解液體積分數為90%時，細菌纖維素產量最高，達到26.5 g/L。酒糟酶解液中含有豐富的木葡糖酸醋桿菌產細菌纖維素所需的營養物質，濃度越高越利于菌群生長。由此可見，酒糟酶解液直接用作培養基進行細菌纖維素發酵是可行的，酒糟酶解液最佳體積分數為90%。

圖7 酶解液體積分數對細菌纖維素產量的影響Fig.7 Effect of enzymatic liquid volume fraction on bacterial cellulose yield

2.4 細菌纖維素膜的含水量

通過測定發現，未堿洗的細菌纖維素膜含水量為92.8%；堿洗后的細菌纖維素膜含水量為99.0%。由此可知，細菌纖維素膜具有極好的持水性，堿洗后的細菌纖維素膜相較于未堿洗的細菌纖維素膜，持水性更好。

2.5 細菌纖維素膜的顯微觀察

由圖8可知，得到的細菌纖維素膜均為由纖細狀纖維絲組成的三維立體納米級網狀結構，多孔且結構緊密。而堿洗后再干燥的細菌纖維素膜（圖8b）相較于未堿洗直接干燥的細菌纖維素膜（圖8a），其纖維絲上附著的殘余營養物質被洗去，纖維絲之間的粘連程度更低，結構更致密，更有利于其后期作為材料的應用。

圖8 細菌纖維素膜冷凍干燥后的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy of bacterial cellulose membrane after freeze drying

3 結論

木葡糖酸醋桿菌BC19-2發酵培養生產細菌纖維素的優化條件：培養基組成為黃酒糟酶解液6%、紅茶2 g/100 mL；培養條件為初始pH 6.0、培養溫度30 ℃、接種量6%；黃酒糟酶解條件為酶解時間3 h，黃酒糟酶解液體積分數90%。在此條件下細菌纖維素產量最高為26.5 g/L，解決了培養基中殘留的紅茶渣對纖維素膜品質影響問題。堿洗后的細菌纖維素膜含水量為99%，極好的持水能力展現了在醫藥等領域的良好應用前景。