生物礦化合成鳥糞石晶體研究★

孫 彬，陶佳麗

（山西工程技術學院，山西 陽泉 045000）

引言

鳥糞石[Mg（NH4）PO4·6H2O]是一種常見的磷酸鹽礦物，屬于斜方晶系，存在于天然的鳥糞中。鳥糞石是一種富含氮、磷元素的天然肥料，具有重要的經濟價值。隨著天然鳥糞石的大量開采，現存的天然鳥糞石儲量急劇下降；而現代農業對氮、磷肥料的需求與日俱增[1-2]。因此，實現鳥糞石的工業化生產十分必要。與常見的化學合成法相比，利用生物礦化得到鳥糞石晶體的方法，兼具經濟效益和環境效益，逐漸引起了研究人員的重視。

河床底部存在大量污泥，厭氧區范圍大且富含有機質，生存著大量的硫酸鹽還原菌[3]，目前關于河床底部沉積物中的厭氧菌誘導鳥糞石礦物的研究較少。本文對河床底部污泥中的一株硫酸鹽還原菌進行分離、鑒定，利用其成功誘導得到鳥糞石，具有重要的經濟價值和研究價值。

1 實驗方法

1.1 菌種來源

本實驗所用樣品取自河流底部的污泥。污泥中有強烈的H2S 氣體的氣味，表明污泥中含有豐富的硫酸鹽還原菌。取深處污泥作為樣品。

1.2 培養基

1.2.1 富集培養基

每1 L 富集培養基溶液所含成分如下：K2HPO40.5 g，NH4Cl 1 g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母浸粉1g，60%的乳酸鈉溶液6 mL，Na2SO40.5 g，Fe（NH4）2-（SO4）20.5 g，抗壞血酸0.5 g，L-Cys 半胱氨酸0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH=6～8，121 ℃滅菌20 min。

Fe（NH4）2（SO4）2和抗壞血酸在高溫環境性質會發生改變，所以先將其配制成溶液，0.22 μm 濾膜除菌。Fe（NH4）2（SO4）2中的Fe2+能與溶液中的S2-反應生成黑色的FeS，可作為硫酸鹽還原菌富集成功的標志[4]。

1.2.2 純化培養基

液體純化培養基所含成分如下：酵母浸粉3 g，KCl 0.25 g，蒸餾水1000 mL。將其添加2%的瓊脂即為固體純化培養基。

1.3 菌株的富集與純化

在200 mL 富集培養基中加入20 g 污泥樣品進行培養，并用液體石蠟封閉瓶內液面，創造相對厭氧的環境。置于30 ℃恒溫厭氧培養箱中靜置培養。當培養基的顏色變成黑色時，表明此時培養基中存在大量的硫酸鹽還原菌（圖1）[5]。

圖1 菌株富集培養

經過富集后的細菌培養液中存在多種細菌，需要固體培養基進行單菌落篩選，挑選單個菌落接到液體培養基中培養，反復進行多次，使菌種得到分離和純化。將純化后得到的單一菌株進行16S rDNA 分析鑒定。用透射電子顯微鏡觀察菌株的形態學特征，并對菌株進行革蘭氏、芽孢、接觸酶、甲基紅、V-P、硫化氫、運動性、三糖鐵、脂酶、脲酶、蛋白酶、纖維素酶、明膠酶耐鹽性等生理生化測試。

1.4 誘導礦化研究

誘導礦化所用培養基為富集培養基，其培養基成分變量為Mg、Ca。設置n（Mg）/n（Ca）比梯度0、2、4、6（表1）。設置實驗組和對照組。實驗組接菌量為1%，對照組中以等量蒸餾水替代菌量，30℃靜置培養。

表1 誘導礦化梯度濃度Mg/Ca 比含量

2 結果與討論

2.1 16S rDNA 分析

得到了長度為1 438 bp 的16S rDNA 序列，使用NCBI 在線blast 對該菌株的16S rDNA 序列進行同源性比對，結果發現，該菌株與腸桿菌屬和非脫羧勒克菌屬的同源性均在97%以上。通過基于16S rDNA 序列構建的系統發育樹分析，結果顯示該菌株與Leclercia adecarboxylata 親緣關系最近（圖2），因此可以確認該菌株為非脫羧勒克菌（Leclercia adecarboxylata）。

圖2 菌株的系統發育樹

2.2 菌體形貌特征

通過高分辨率投射電鏡觀察，菌株的基本特征為：菌體為短桿狀，長約1 000 nm，寬約500 nm，生殖方式為二分裂（見圖3）。

圖3 菌株單細胞形態及生殖分裂方式透射電鏡圖

2.3 菌株的生理生化鑒定

如表2 所示，結果表明，該菌株為革蘭氏陰性桿菌，不形成芽孢，有動力，不耐鹽。接觸酶，淀粉酶為陽性；MR 為弱陽性；脂酶，脲酶，蛋白酶，纖維素酶均為陰性；可利用乳糖發酵；不能利用含硫氨基酸產硫化氫，但可利用含硫化合物。

表2 該菌株與同種非脫羧勒克菌的鑒別結果比較

2.4 誘導礦化結果

誘導礦化18 d 后，在顯微鏡下觀察實驗組的沉淀。從圖4-1、4-2 可知，Mg/Ca 比為0 和2 的情況下，沒有礦物形成；從圖4-3、圖4-4 可知，n（Mg）/n（Ca）比為4 和6 的情況下，有規則礦物形成。對照組中沒有礦物沉淀。這些結果說明細菌對礦物的沉淀有促進作用，同時n（Mg）/n（Ca）比同樣對礦物的形成有重要影響。

圖4 實驗組礦物的顯微鏡圖像（a、b、c、d 分別為n（Mg）/n（Ca）比0、2、4、6 的培養基礦物）

XRD 結果（第18 頁圖5）可以看出，n（Mg）/n（Ca）比為0 和2 的實驗組均未形成晶形礦物，而n（Mg）/n（Ca）比為4 和6 的實驗組均出現明顯特征峰。通過晶體比對，n（Mg）/n（Ca）比為4 和6 的實驗組所形成的礦物均為鳥糞石。與鳥糞石標準PDF 卡片（晶格參數為a=6.945，b=11.208，c=6.135）的峰強和峰位相比較，峰強十分相近，半峰寬略大，而且本實驗所得鳥糞石晶體XRD 衍射峰位相對標準峰位左移，也就是說，生物誘導的鳥糞石與自然形成的鳥糞石相比，原子排列結構相同，但結晶程度略低，晶胞尺寸較大，晶形發生畸變。這表明細菌對晶核形成及晶體生長過程具有一定的影響。

圖5 菌株誘導礦物的XRD 譜圖

3 結論

生物礦化合成鳥糞石是一種兼具經濟效益、環境效益的方法。從河床底部沉積物中篩選得到一株硫酸鹽還原菌，該菌株經分子生物學與生理生化鑒定為脫羧勒克菌。利用該細菌成功誘導得到鳥糞石晶體，為鳥糞石的工業化生產提供一種有效方案。