固定化培養中氮磷濃度對鈍頂螺旋藻生長及其代謝產物和葉綠素熒光參數的影響

崔 巖，劉海燕，李武陽,2，王麗娟，羅光宏*

(1 河西學院，甘肅省微藻技術創新中心，甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖 734000；2 蘭州交通大學 生物與制藥工程學院,蘭州 730070)

螺旋藻作為國內外研究與開發規模最大的經濟微藻，生長速度快且可以在堿性環境中高效利用CO2或碳酸鹽。螺旋藻還含有豐富的β-胡蘿卜素、葉綠素、蛋白質和多糖等活性物質，是集營養和藥用于一身的最佳天然綠色保健食品，被聯合國糧農組織(FAO)譽為“21世紀人類最理想的天然保健食品”[1-2]。中國螺旋藻產業發展迅速，自20世紀80年代初開展螺旋藻養殖技術研究，90年代初期進入產業化推廣階段，至90年代中期，中國螺旋藻養殖面積達到200萬m2，年產能達2 000 t。目前，中國螺旋藻生物質年生產能力約1萬t[3-4]，主要采用傳統的液體懸浮式培養，包括開放式跑道池和密閉光生物反應器[5]。開放式跑道池的建造和運行成本較低，但細胞生長速度與培養密度均較低，且占地面積大，系統還存在著易受污染、培養條件不穩定等難以克服的弱點。密閉光生物反應器可以有效控制培養條件，顯著提高藻細胞生長速度與培養密度，但造價昂貴、運行成本高、難以放大用于規模培養[6]。近年來，固定化生物膜的培養方式獲得了越來越多的關注。區別于懸浮式培養，該培養方式通過將細胞固定在材料表面并形成連續生長的生物膜，可以極大地降低耗水量和采收能耗。同時，研究表明生物膜中細胞對光和CO2的利用率遠高于懸浮式培養[7]。因此，研究影響固定化生物膜培養方式的因素，開發低成本、可規模化的培養系統，已成為微藻養殖領域的一個重要方向[8]。

氮、磷是調節細胞生長和代謝的必需營養因子，在細胞生命過程中起著不可或缺的作用。研究表明，氮、磷等營養元素對微藻生物膜的形成和生長至關重要[9]。目前，關于螺旋藻生物膜的研究主要集中在固定材料的篩選和反應器的構建方面[7-10]，有關氮、磷對螺旋藻生物膜的影響研究還未見報道，因此，本研究開展了不同氮、磷濃度下固定化鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)生物膜的培養實驗，分析氮和磷濃度對藻細胞生長、代謝產物以及葉綠素熒光參數的影響規律，從而為制定低耗、高效的規模化培養策略，調控代謝產物和提高螺旋藻利用效率提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 藻種培養及處理

鈍頂螺旋藻 (Spirulinaplatensis)由甘肅省微藻技術創新中心提供。采用Zarrouk培養基[11]進行培養，1 L溶液中含NaHCO316.8 g,NaCl 1.0 g,K2SO41.0 g,NaNO32.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl20.08 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,Na2EDTA 0.08 g,A5微量元素1 mL。其中，A5微量元素配方如下：H3BO32.86 g·L-1,MnCl2·4H2O 1.8 g·L-1,ZnSO4·7H2O 0.22 g·L-1,(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.02 g·L-1,CuSO4·5H2O 0.08 g·L-1,CoCl2·6H2O 0.04 g·L-1。

采用單層傾斜平板系統，支撐板表面是有利于螺旋藻吸附固定的材料，將待培養的藻種接種至固定材料無紡布表面，初始接種密度為7～9 g·m-2。培養液通過噴灑系統分布于材料表面并保持濕潤，藻細胞在吸附層生長并形成一定厚度的生物膜，收獲時用刮板將細胞從吸附層上刮下即可。培養光照強度為100 μmol·m-2·s-1，培養溫度為25 ℃。

1.2 觀測指標及方法

1.2.1 螺旋藻生長參數測定細胞密度時，將吸附膜上的藻細胞(接種面積為S，m2)用水沖洗下來，通過抽濾裝置過濾到預先稱重的濾膜(W1，g)上，烘箱105 ℃ 烘干至恒重(W2，g)，最后依據公式(1)和(2)分別計算吸附膜上的生物量密度(Wt，g·m-2)和相應的生物量產率(P，g·m-2·d-1)。

Wt=(W2-W1)/S

(1)

P=(Wt-W0)/t

(2)

其中，W0為接種時的細胞濃度(g·m-2)，t為培養時間(d)。

1.2.2 螺旋藻葉綠素和類胡蘿卜素含量取冷凍干燥后的藻粉20 mg，加入20 mL 80%丙酮溶液，低溫超聲20 min，于4 ℃放置24 h，離心后測定上清液在波長663、646和470 nm 處的吸光值OD663、OD646和OD470。按式(3)和(4)計算葉綠素a (Chla)和類胡蘿卜素(Cart.)含量[11]：

Chla(mg·L-1)=12.21OD663-2.81OD646

(3)

Cart.(mg·L-1)=(1000OD470-1.63Chla)/221

(4)

1.2.3 螺旋藻藻膽素含量取冷凍干燥后的藻粉20 mg，加入50 mL 磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0)，混勻后低溫超聲20 min,于-80 ℃凍融循環3次，離心后測定上清液在562、620和652 nm處的吸光度OD562、OD620、OD652。藻藍素(PC)、別藻藍素(APC)和藻紅素(PE)的含量計算如下[15]：

PC(g·L-1)=0.187OD620- 0.089OD652

(5)

APC(g·L-1)=0.196A652-0.041A620

(6)

PE(g·L-1)=0.104A562-0.251PC-0.088APC

(7)

1.2.4 螺旋藻可溶性蛋白及多糖含量將待測細胞用一定量的水沖洗并離心，上清液用于測定胞外多糖含量，藻渣冷凍干燥后稱取總重。取20 mg藻粉，加入5 mL PBS 緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.8)，混勻后低溫超聲20 min，并于-80 ℃反復凍融3次，離心后上清液用于測定胞內多糖和可溶性蛋白含量[16]。

可溶性糖含量的測定采用硫酸蒽酮法[17]。稱取0.1蒽酮，溶于100 mL 80%濃硫酸中。取2 mL上清液，置于15 mL比色管中，隨后加入5 mL配制的硫酸蒽酮溶液，充分振蕩后立即放入沸水浴中，保溫15 min，取出后用自來水冷卻，在620 nm波長下測定其吸光度OD620，根據標準曲線計算樣品中的可溶性多糖含量。

可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[11]。取上清液1 mL，置于10 mL比色管中，加入5 mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，混合放置5 min后，在595 nm下比色，記錄吸光度OD595，并通過標準曲線計算樣品中的蛋白質含量。

1.2.5 細胞形態觀察采用光學顯微鏡(BX51,Olympus)觀察螺旋藻的細胞形態。采用S-3700N(Hitachi) 掃描電子顯微鏡對真空冷凍干燥并鍍金處理后的藻膜樣品進行觀察，拍攝其表面結構。

1.2.6 葉綠素熒光參數通過葉綠素熒光儀(PAM-100，Waltz)每天定時測定各濃度氮、磷營養條件下的螺旋藻葉綠素熒光誘導動力學曲線和快速光響應曲線，測定前將樣品置于暗處適應15 min。測定葉綠素熒光誘導動力學曲線時，先用弱光(小于1 μmol·m-2·s-1)照射樣品測定初始熒光(Fo)，然后打開飽和脈沖光 (2 800 μmol·m-2·s-1)，一個脈沖后關閉，得到黑暗中的最大熒光(Fm)，隨后開啟光化光(85 μmol·m-2·s-1)，讓樣品進行正常的光合作用，當熒光基本穩定時測定穩態熒光(Fs)，之后再進行飽和脈沖光處理，一個脈沖關閉后，得到光下的最大熒光(Fm′)。充分暗適應PSⅡ的最大光轉化效率(Fv/Fm)、實際光能轉化效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(qP)等參數值均是在選定模式下系統自動計算生成。測定快速光響應曲線時，將樣品暴露在連續光強梯度(PAR分別為 13、22、35、85、156、210、364、576、901和1 393 μmol·m-2·s-1)下，測定光合電子傳遞速率ETR[18-19]。

1.3 數據處理

每組實驗均設3個重復，利用SPSS 22.0進行數據方差分析(ANOVA)和 Duncan檢驗；檢驗水平α=0.05，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同氮、磷濃度對螺旋藻生長的影響

各氮、磷濃度條件下螺旋藻生物量均隨培養時間的增加而增加(圖1)。其中，螺旋藻生物量密度在30 mmol·L-1氮濃度處理時達到最大值，并且在培養周期內(1～10 d)顯著高于其余氮濃度處理(P<0.05)，而在15 和45 mmol·L-1氮濃度處理中培養8 d之后顯著高于5 mmol·L-1氮濃度處理(P<0.05)，表明氮濃度過低會降低螺旋藻的產量。同時，在培養周期內，螺旋藻生物量密度在3.0 和4.5 mmol·L-1磷濃度處理時顯著高于0.5 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理(P<0.05)，但前兩者間在培養7 d之后并無顯著性差異，總體上螺旋藻生物量密度隨著磷濃度增加先升高后趨于平穩。

另外，培養10 d后收獲藻體，并計算相應的生物量產率(表1)。結果表明，隨著培養基中氮濃度的增加，螺旋藻的生物量產率呈先增加后降低的變化趨勢，并在氮濃度為30 mmol·L-1時達到最大(8.31 g·m-2·d-1)；當氮濃度繼續增加時(45 mmol·L-1)，螺旋藻的生物量產率顯著降低。與此同時，隨著培養基中磷濃度的增加，螺旋藻藻生物量產率的變化趨勢與氮濃度處理的表現一致，即先升高后降低，當磷濃度為3.0 mmol·L-1達到最大(8.06 g·m-2·d-1)；但當磷濃度繼續增加時(4.5 mmol·L-1)，生物量產率稍有降低并保持在較高水平。

表1 不同氮、磷濃度培養基中螺旋藻的生物量產率Table 1 The biomass productivity of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

同期不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異圖1 不同氮、磷濃度培養基中螺旋藻生物量密度的變化The different normal letters within same time point indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig.1 The biomass density of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

2.2 不同氮、磷濃度對螺旋藻細胞形態的影響

在不同氮、磷濃度條件下培養10 d后，將氮濃度為5 mmol·L-1和30 mmol·L-1、磷濃度為0.5 mmol·L-1和3.0 mmol·L-1的處理在光學顯微鏡(BX51,Olympus)和掃描電子顯微鏡(日立S-3700N)下進行觀察。結果(圖2)顯示：在光學顯微鏡下，30 mmol·L-1氮濃度處理和3 mmol·L-1磷濃度處理的螺旋藻藻絲都較長，具有10個或更多螺旋(圖2，A、C)；而5 mmol·L-1氮濃度和0.5 mmol·L-1磷濃度的處理中，螺旋藻的藻絲較短，螺旋變少(圖2，B、D)。在掃描電子顯微鏡下，相較于氮濃度為30 mmol·L-1和磷濃度為3.0 mmol·L-1的處理(圖2，E、G)，氮濃度為5 mmol·L-1和磷濃度為0.5 mmol·L-1的處理(圖2，F、H)藻絲體螺旋度減小，部分藻絲體變成直線形，而長的藻絲和高的螺旋度有助于螺旋藻形成更為穩定的生物膜，進而增加單位面積的產量。

2.3 不同氮、磷濃度對螺旋藻光合色素含量的影響

螺旋藻光合色素含量在氮濃度處理間或者磷濃度處理間均存在顯著性差異，并隨著培養基中氮、磷濃度的增加均呈現先升后降的變化趨勢，且均在30 mmol·L-1氮濃度或者3.0 mmol·L-1磷濃度條件下達到最大值(圖3)。

首先，螺旋藻葉綠素a含量在30 mmol·L-1氮濃度處理時達到最大值(14.89 mg·g-1)并顯著高于其余氮濃度處理，而15 和45 mmol·L-1氮濃度處理又顯著高于5 mmol·L-1氮濃度處理(P<0.05)，總體上與螺旋藻生物量的變化趨勢一致。同時，螺旋藻類胡蘿素和藻膽素(藻藍素、異藻藍素和藻紅素)均在30 和45 mmol·L-1氮濃度處理時顯著高于5和15 mmol·L-1氮濃度處理(P<0.05)，但前兩者間和后兩者間均無顯著性差異，總體上隨著氮、磷濃度增加先緩慢升高后趨于平穩。

A～D為光學顯微鏡觀察，E～H為掃描電子顯微鏡觀察：A、E.30 mmol·L-1氮濃度處理；B、F.5 mmol·L-1氮濃度處理；C、G.3.0 mmol·L-1磷濃度處理；D、H.0.5 mmol·L-1磷濃度處理圖2 不同氮、磷濃度培養條件下螺旋藻細胞的形態變化A-D are optical microscope observation,while E-H are scanning electron microscope observation:A,E.30 mmol·L-1 nitrogen treatment;B,F.5 mmol·L-1 nitrogen treatment;C,G.3.0 mmol·L-1 phosphorus treatment;D,H.0.5 mmol·L-1 phosphorus treatment Fig.2 Morphological changes of S. platensis cells under different nitrogen and phosphorus concentrations

其次，螺旋藻葉綠素a含量在3.0 mmol·L-1磷濃度處理時達到最大值14.37 mg·g-1，并顯著高于其余磷濃度處理，1.5 和4.5 mmol·L-1磷濃度處理又顯著高于0.5 mmol·L-1磷濃度處理(P<0.05)，總體上與螺旋藻生物量的變化趨勢一致。而螺旋藻類胡蘿素含量在3.0 和4.5 mmol·L-1磷濃度處理時顯著高于0.5 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理(P<0.05)，但前兩者間和后兩者間并無顯著性差異，總體上隨著磷濃度增加先升高后趨于平穩。同時，螺旋藻藻藍素、異藻藍素和藻紅素含量在各磷濃度處理間均存在顯著性差異(P<0.05)，并均在磷濃度為3.0 mmol·L-1時達到最高值，分別為15.93%、8.87%和1.40%，在4.5 mmol·L-1磷濃度處理時次之，而在1.5 mmol·L-1磷濃度處理時最低。

2.4 不同氮、磷濃度對螺旋藻葉綠素熒光參數的影響

首先，最大光能轉換效率(Fv/Fm)反映了PSⅡ反應中心處于開放時的最大量子產率，即能量捕獲效率。在培養基中氮濃度一定時，不同磷濃度處理螺旋藻的Fv/Fm隨著培養時間均呈先上升后下降的趨勢(圖4)。其中，4.5 mmol·L-1磷濃度處理螺旋藻的Fv/Fm在培養的第1天就達到峰值，而3.0 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理則在培養第2天達到峰值，0.5 mmol·L-1磷濃度處理則一直處于波動下降之中；在培養結束時，各濃度磷處理螺旋藻的Fv/Fm表現為3.0 mmol·L-1>4.5 mmol·L-1>1.5 mmol·L-1>0.5 mmol·L-1,這與螺旋藻葉綠素含量的變化趨勢一致。在基質中磷濃度一定時，各氮濃度處理螺旋藻的Fv/Fm隨著培養時間均呈波動下降趨勢(圖4)。其中，在培養的第1天，5 mmol·L-1氮濃度處理螺旋藻的Fv/Fm的下降幅度最大，而30 mmol·L-1氮濃度處理的下降幅度最小；在培養結束時，螺旋藻的Fv/Fm值以45 mmol·L-1氮濃度處理最大，5 mmol·L-1氮濃度處理最小。

相同色素內不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異圖3 不同氮、磷濃度培養條件下螺旋藻光合色素含量的變化The different normal letters within same pigment indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig.3 The photosynthetic pigment contents of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

圖4 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻最大光能轉換效率(Fv/Fm)的變化Fig.4 The Fv/Fm of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

其次，隨著光合有效輻射(PAR)強度的增加，各氮、磷濃度處理組螺旋藻PSⅡ光合電子傳遞效率[ETR(Ⅱ)]光響應曲線均呈現先上升后降低的變化趨勢，說明螺旋藻PSⅡ的光化學速率在低光照條件下得到提高，而在高光照條件下會受到抑制。螺旋藻ETR(Ⅱ)在培養基中磷濃度固定時表現為45 mmol·L-1>30 mmol·L-1>15 mmol·L-1>5 mmol·L-1，在培養基中氮濃度固定時表現為3.0 mmol·L-1>4.5 mmol·L-1>1.5 mmol·L-1>0.5 mmol·L-1(圖5)。在培養基中磷元素充足的情況下，螺旋藻ETR明顯受氮濃度影響，且氮濃度越低，ETR值越低，下降越快；在培養基中氮濃度一定時，螺旋藻ETR始終以3.0 mmol·L-1磷濃度處理最高，這與螺旋藻Fv/Fm和葉綠素a含量的變化規律一致。

圖5 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻電子傳遞速率ETR的變化Fig.5 The ETR of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

另外，實際光能轉化效率(ΦPSⅡ)反映PSⅡ反應中心部分關閉時所吸收的量子產額；光化學淬滅系數(qP)也是捕獲的光子能量用于光化學反應的能力指標，表示PSⅡ開放的反應中心所占比例；初始熒光(Fo)來自天線色素，是已經暗適應的光合機構全部PSⅡ都開放時的熒光強度。圖6顯示，螺旋藻Fo、ΦPSⅡ、qP在各濃度氮、磷處理間差異不顯著，說明本研究設置的氮、磷鹽濃度處理在整體上對這幾個熒光參數影響較小。

2.5 不同氮、磷濃度對螺旋藻代謝產物的影響

圖7顯示，螺旋藻可溶性蛋白含量隨著培養基中氮濃度的增加而逐漸顯著增加，且在各個氮濃度處理間均存在顯著差異(P<0.05)；而可溶性蛋白含量又隨著培養基中磷濃度的增加而先升高后降低，并在3.0 mmol·L-1磷濃度時達到最高值，且顯著高于其余處理，但在4.5 mmol·L-1磷濃度處理與0.5 和1.5 mmol·L-1磷濃度處理間無顯著性差異(P>0.05)。同時，螺旋藻可溶性蛋白產率均隨著培養基中氮、磷濃度的增加而先升后降，且分別在30 mmol·L-1氮和3.0 mmol·L-1磷時達到最高值，分別為3.54和3.33 g·m-2·d-1。可見，培養基中氮、磷濃度偏高或者偏低均會降低螺旋藻可溶性蛋白產率。

圖7 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻可溶性蛋白含量及產率的變化Fig.7 The soluble protein content and productivity of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

同時，培養基中氮濃度也對螺旋藻多糖積累有顯著影響(圖8)。各氮濃度處理的多糖含量存在顯著差異(P<0.05)，并在氮濃度為15 mmol·L-1時螺旋藻胞外和胞內多糖含量均達到最大值，分別為89.42和116.26 mg·g-1，比30 mmol·L-1氮濃度處理分別顯著增加118.79% 和40.44%。同時，隨著培養基中磷濃度的增加，螺旋藻胞外多糖含量顯著降低，在0.5 mmol·L-1磷濃度處理時達到最高值(99.87±6.18) mg·g-1，但胞內多糖含量并沒有隨磷濃度發生明顯增加。另外，不同氮、磷濃度處理下多糖產率與多糖含量的變化趨勢一致，即在15 mmol·L-1氮和0.5 mmol·L-1磷時獲得最高值，分別為1.34和1.03 g·m-2·d-1。螺旋藻在氮、磷等營養限制條件下雖不利于藻生物量的增加，但是卻會刺激藻積累大量糖類。

圖8 不同氮、磷濃度處理下螺旋藻可溶性糖含量及產率的變化Fig.8 The polysaccharide content and productivity of S. platensis under different nitrogen and phosphorus concentrations

3 討 論

在微藻培養的營養鹽中，氮源是研究較多的營養因素之一，它是合成藻體內蛋白質、核酸和葉綠素的基本元素。磷雖然需要的不多，但它是細胞核酸、蛋白質和磷脂的主要成分，也是調節微藻細胞生長和代謝的必需營養因子之一[6]。本研究結果表明，當培養基中氮、磷營養充足時，螺旋藻細胞合成較多的蛋白質，促進細胞的分裂和生長，單細胞藻絲較長；當基質中氮、磷營養缺乏時，會影響藻細胞葉綠素合成和光合作用的進行，單細胞藻絲變短，螺旋變少；隨著培養基質中氮、磷含量降低，螺旋藻生長速率下降，細胞多糖含量增加。營養鹽的匱乏致使藻細胞處于饑餓狀態，蛋白質合成受阻，碳水化合物多數轉化為多糖，從而引起細胞多糖含量升高[20]，并且磷源限制程度越嚴重，螺旋藻蛋白質含量越低，多糖含量越高。鄭怡等[13]發現氮源濃度(試驗范圍為1.0～2.5 g·L-1)對極大螺旋藻多糖的含量有顯著影響，且隨著培養液中氮源濃度的降低螺旋藻胞外多糖含量增加，當NaNO3濃度降至1.0 g·L-1時，胞外多糖含量達到最高。陳浩等[12]研究了磷濃度對鈍頂螺旋藻生長代謝的影響，實驗發現螺旋藻總糖含量隨著磷源濃度的增加顯著下降，并在磷源濃度為0.005 g·L-1時達到最高。本研究結果與以上研究結果一致，在培養基中氮濃度為15 mmol·L-1(相當于NaNO3濃度為1.275 g·L-1)時，鈍頂螺旋藻胞外和胞內多糖的含量均達到最大值；同時，螺旋藻胞外多糖含量隨著基質中磷濃度的增加而降低，在0.5 mmol·L-1磷濃度處理中胞外多糖含量達到最高。目前關于螺旋藻代謝產物如多糖和藻藍蛋白的研究大多側重于其分離純化及結構與功能方面，而有關培養條件對代謝產物的影響則很少涉及。因此，通過對螺旋藻代謝產物的高產條件及機理研究建立高產的生產模式，具有重要的實際應用價值。

螺旋藻的光合色素包括葉綠素a、類胡蘿卜素和藻膽素三大類，光合作用是在他們的共同作用下完成的。光能吸收傳輸路線是光照→藻紅素(PE)→藻藍素(PC)→別藻藍素(APC)→葉綠素a。前三者傳遞光能，而葉綠素a作為光合作用反應中心將光能轉化為電能[15,32]。本研究結果表明，在氮源缺乏的條件下，鈍頂螺旋藻合成的光合色素減少，且降解的細胞內氮主要用于合成核酸、蛋白質、脂質和碳水化合物等細胞主要組成物質。Pancha等的轉錄組學和蛋白組學分析也發現了類似的結果，即在氮限制條件下微藻細胞中并沒有新的光合色素合成[33]。氮素的缺乏影響光合色素的合成，進而削弱微藻的光合作用。另外，本研究進一步發現，鈍頂螺旋藻生物膜對氮濃度的耐受程度更強，在高氮濃度(45 mmol·L-1)培養下，其熒光參數Fv/Fm、ETR、ΦPSⅡ都處在較高水平，同時生物質產量和產率也較高。

已有研究表明開放池和密閉式光生物反應器兩種培養模式單位面積需水量分別為300和100 L·m-2[34]，而固定化生物膜培養模式可將用水量控制在60 L·m-2[35-36]。開放池系統的培養液深度通常在15～30 cm之間，以水平跑道式環形池居多，采用葉輪轉動的方式使培養液在池內混合循環，從而防止藻體沉底并提高藻體的光能利用率，流動所產生的剪切強度難以精準測量和控制。此外，由于培養液層淺，CO2作為碳源的利用率不會超過20%，直接導致開放池培養成本升高[6]。目前采用開放池進行戶外大規模培養的藻種只有螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)和雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)等少數幾種，但都存在著生物量低(0.5～1.0 g·L-1左右)，采收成本較高的問題[5-6]。光封閉反應器可以有效控制培養條件，控制污染，實現純種培養，且CO2及營養鹽損失小，但缺點在于設備投資成本高，難于放大用于規模培養。特別是有些微藻嗜好附著于反應器內表面生長，不僅阻礙了光能的滲透，還給生物量的采收和反應器的清洗造成困難。本研究表明固定化生物膜培養模式中，在不降低生物量、減少系統用水量的前提下，可以快速地實現生物量的積累，而且采收便捷，同時可根據目標產物的要求制定相應的氮、磷營養元素調控機制，為設計和建造更高效的、適合規模化生產螺旋藻的系統提供了理論基礎依據。

4 結 論

氮、磷水平對固定化鈍頂螺旋藻生物膜的生長及代謝產物有重要影響。生物膜上附著的細胞干重隨著氮、磷濃度的增加而增大，并在氮濃度30 mmol·L-1或磷濃度3 mmol·L-1的條件下達到最高值。隨著氮、磷濃度的降低，螺旋藻多糖含量增加，蛋白質含量下降，且磷源限制程度越嚴重，螺旋藻蛋白質含量越低，多糖含量越高。因此在生產應用中可通過調控氮、磷濃度來促進相應目標產物的合成積累。

隨著基質中氮、磷濃度的降低，螺旋藻中的葉綠素a、類胡蘿卜素和藻膽素的等光合色素含量減少。光合色素的減少削弱了螺旋藻生物膜的光合作用效率，葉綠素熒光參數(Fv/Fm)和 電子傳遞速率(ETR)降低。與磷濃度相比，螺旋藻生物膜對氮濃度的耐受程度更強，在高氮濃度(45 mmol·L-1)培養下，螺旋藻葉綠素熒光參數都處在較高水平，同時生物質產量也較高。利用葉綠素熒光技術可對螺旋藻生物膜的光合生理狀況和營養條件進行快速的測定和診斷。