山茶和西洋杜鵑花瓣及葉片的栓塞脆弱性比較

夏 英，李婕婷，唐 婧，唐 明，張習敏

(1貴州師范大學貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點實驗室，貴陽550025；2 貴州師范大學西南喀斯特山地生物多樣性保護國家林業(yè)和草原局重點實驗室，貴陽550025；3 貴州省高等學校高山杜鵑病蟲害綠色防控重點實驗室，貴陽550025；4 貴州師范大學 生命科學學院，貴陽550025)

世界氣象組織在《2019年全球氣候狀況聲明》報告，2019年全球平均溫度比工業(yè)化前高出1.1 ℃[1]，并且未來全球將會持續(xù)變暖[2]。隨著全球氣候變暖，引發(fā)的極端干旱事件在全球范圍內(nèi)廣泛分布[3]，干旱對森林、農(nóng)業(yè)、社會經(jīng)濟等造成較大損失。據(jù)統(tǒng)計，在各種自然災害中，氣象災害造成的經(jīng)濟損失約占70%以上，其中干旱災害占到50%左右[4]。

中國是世界上植物資源最為豐富的國家之一，觀賞植物物種多樣，每年都有大量花卉植物由中國傳到世界各地[5]。隨著人們生活水平的提高，花卉產(chǎn)業(yè)已經(jīng)逐漸成為最具活力的第三產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)統(tǒng)計，2016年中國的花卉生產(chǎn)總面積就達133.04萬hm2，比2015年增長了1.91%[6]。花卉植物在現(xiàn)代社會中應用廣泛，如園林造景、城市綠化、室內(nèi)觀賞等。由于全球氣候變化引發(fā)的自然干旱對植物生長發(fā)育產(chǎn)生嚴重影響[7]，在水資源短缺的情況下選擇抗旱強的花卉植物是未來必須考慮的問題。

近年來，干旱誘導植物死亡的機制備受關注。其中，干旱引起木質部栓塞是制約植物存活、生長發(fā)育的重要因素之一[8-9]。栓塞脆弱性可以反映木質部栓塞大小，同時它與植物的抗旱存在正相關性，栓塞脆弱性越大，植物越不耐旱，反之亦然。因此，通過分析木質部栓塞脆弱性從而評估植物的耐旱性，已在枝條和葉片中廣泛報道[10-15]。花是被子植物繁殖、進化和多樣性的重要器官[16-17]，也是觀賞植物的經(jīng)濟價值所在，目前其栓塞脆弱性的研究報道相對較少[18-19]。

西洋杜鵑(Rhododendronhybridum)花色較多、花型豐富，是中國重要的園林花卉和室內(nèi)裝飾花卉，常見于巷道、庭院、城市綠化[20]。山茶(Camelliajaponica)花期較長，花色、花形豐富，宜盆栽裝點景色，常用來美化居室，布置廳堂、會場等，也是一種常見的城市綠化植物。然而，這兩種植物的抗旱性并不清楚，本研究利用光學技術構建花瓣和葉片的栓塞脆弱性曲線，并比較它們的栓塞脆弱性大小，為篩選抗旱性花卉植物提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

參試植物為塑料盆(盆高13.5 cm，直徑14 cm)栽的山茶(Camelliajaponica)和西洋杜鵑(Rhododendronhybridum)，于2021年12月購置于貴州省黔南州惠水縣花卉基地(兩種植物均帶花苞)，培養(yǎng)于貴州師范大學植物生理與發(fā)育調(diào)控重點實驗室溫室內(nèi)(光周期12 h，溫度22 ℃，光照強度350 μmol·m-2·s-1，相對濕度60%～70%)。西洋杜鵑和山茶分別培養(yǎng)至2022年1月和2022年3月時開始開花，待部分花朵完全開放后(圖1)，立即開始進行干旱處理。

圖1 山茶(A)和西洋杜鵑(B)Fig.1 C. japonica (A) and R. hybridum (B)

1.2 山茶和西洋杜鵑抗旱性測定

為了比較山茶和西洋杜鵑的抗旱性，首先對兩種植物進行抗旱性測定。干旱處理前先使土壤水分含量達到飽和，然后對盆栽的山茶和西洋杜鵑進行自然干旱處理，以正常澆水為對照。之后每隔3 d用露點水勢儀測量實驗植物的花瓣、葉片和土壤的水勢，共計持續(xù)干旱處理12 d，測量時間在上午8:00～11:30間完成。每個處理設置3個重復，每個重復3盆植株。

1.3 花瓣和葉片的光學栓塞脆弱性曲線構建

參考Brodribb 等[12]的光學技術方法并略有修改，在正常澆水的3盆植株上，將帶有葉片和花瓣的枝條剪下(約10 cm)，立即插入盛有水的燒杯中使枝條吸水至飽和(水化)，防止測量之前由于脫水而產(chǎn)生的空穴化。水化后將葉片(枝條頂端往下第5片)或花瓣放置在立體顯微鏡(XTL-6745TJ4-T1000,Suzhou Beitega Optoelectronic Technology Company Limited,China)的載物臺上，并用透明膠帶將組織固定，防止脫水后卷曲。光從目標組織下方均勻照射，以產(chǎn)生透射光圖像，設置顯微鏡上的相機對組織進行自動拍照，每60 s捕獲1張圖像，直到觀察到葉片或花瓣褐變。在此期間，將正常澆水植株的另外枝條剪下進行自然干旱，然后取枝條頂端往下第5～8片葉片或花瓣，采用露點水勢儀(Gene Company Limited,WP4-T,USA)測量它們的水勢。

通過使用ImageJ(National Institute of Health,New York,NY,USA)軟件中的圖像減法對干旱過程中捕獲的圖像序列進行分析，從而識別和量化栓塞事件。將連續(xù)的圖像之間進行相減產(chǎn)生一組差異圖像，這些圖像的相同區(qū)域會產(chǎn)生一個黑色的背景，而變化區(qū)域會突出為白色(包括栓塞、光的不穩(wěn)定、葉片卷曲、蟲子運動等事件)。然后調(diào)節(jié)閾值，手動去除與空化事件無關的“噪音”，產(chǎn)生圖像堆棧，僅包含栓塞事件相關的像素。測量這些圖像堆棧，從而確定每個圖像中栓塞像素的總數(shù)。計算堆棧中累積的總像素數(shù)(計為100%的栓塞)，每張圖像中的總像素數(shù)占總像素數(shù)的百分比即為導管栓塞百分數(shù)。再利用導管栓塞百分數(shù)和水勢進行S型函數(shù)擬合，獲得栓塞脆弱性曲線。最后，為了可視化栓塞在葉片或花瓣上擴散的動態(tài)，根據(jù)栓塞事件出現(xiàn)的時間在連續(xù)的圖像上著色[21]。

1.4 形態(tài)特征測量

在干旱處理當天，取正常澆水植株枝條頂端往下第5～8葉片，剪切面積約0.5 cm×0.5 cm的成熟葉片和花瓣，制成石蠟切片并在顯微鏡下拍照，用Image J圖像分析軟件測量花瓣和葉片的厚度、上表皮和下表皮厚度、葉片的柵欄組織和海綿組織厚度[22]。葉脈密度測定參照Roddy 等的方法[23]，將花瓣和葉片脫色至透明，然后置于顯微鏡下拍照，用Image J軟件計算葉脈密度(選取范圍內(nèi)葉脈的長度之和/選取的面積)。氣孔密度測定參照宋艷波等方法[24]，在葉片背面涂上薄薄一層透明的指甲油，靜置30 min，待指甲油自然晾干后用鑷子輕輕撕取油膜，油膜放在載玻片上置于顯微鏡下觀察，記錄氣孔數(shù)量，計算氣孔密度(氣孔數(shù)量/視野面積)。

1.5 組織含水量和干物質含量測定

干旱處理當天，取正常澆水植株枝條頂端往下第5～8葉片，用直徑為8 mm的打孔器，在花瓣或葉片上取20片圓片，立即稱量鮮重，然后將樣品放入已升溫至105 ℃烘箱中殺青30 min，于70 ℃烘干至恒重，稱量干重，通過以下公式計算含水量和干物質量。

單位面積含水量=(鮮重-干重)/面積；

單位面積干質量=干重/面積。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理；利用SPSS 25進行獨立樣本t檢驗(P<0.05)；采用SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 山茶和西洋杜鵑的抗旱性比較

圖2顯示，山茶和西洋杜鵑生長土壤水勢在自然干旱早期(第0～6天)與對照相比均變化不顯著，而從第9天開始顯著降低(圖2)；在自然干旱第9和12天，山茶和西洋杜鵑生長土壤水勢之間并沒有顯著差異(圖2)。這表明停止?jié)菜螅瑑煞N植物生長土壤水分保持一致且是呈現(xiàn)連續(xù)降低的，并沒有由于植物蒸騰速率差異引起土壤水分顯著改變。

同時，干旱脅迫后山茶和西洋杜鵑葉片和花瓣水勢測定結果(圖3)顯示，與正常澆水(對照)相比，自然干旱后第0～9天后，山茶葉片和花瓣水勢未出現(xiàn)顯著變化(圖3，A、C)，而西洋杜鵑的葉片和花瓣水勢在自然干旱后第9天顯著降低(圖3，B、D)；在自然干旱持續(xù)到第12天時，兩種植物葉片和花瓣的水勢均比對照顯著降低(圖3)，此時從形態(tài)表型(圖4)上來看，西洋杜鵑已全部萎蔫，而山茶只有少數(shù)花朵出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象(白色箭頭所示)。這些結果表明，兩種觀賞植物葉片和花瓣的水勢在干旱脅迫下均表現(xiàn)出下降趨勢，但西洋杜鵑下降得更快、幅度更大，抗旱性較差。

同期不同小寫字母代表對照和干旱處理之間在0.05水平差異顯著(P <0.05)圖2 干旱脅迫下山茶和西洋杜鵑土壤水勢比較Different normal letters within same time point represent the significant difference between the control and drought treatment at 0.05 level (P <0.05)Fig.2 Comparison of soil water potential between C. japonica and R. hybridum under drought stress

ns代表對照和干旱處理之間的差異不顯著，*代表對照和干旱處理之間在0.05水平差異顯著(P <0.05)圖3 干旱脅迫下山茶葉片(A)、西洋杜鵑葉片(B)、山茶花瓣(C)和西洋杜鵑花瓣(D)水勢ns represents no significant difference between control and drought treatment,* represents significant difference between control and drought treatment at 0.05 level (P <0.05)Fig.3 Water potential of C. japonica leaf (A),R. hybridum leaf (B),C. japonica petal (C) and R. hybridum petal (D) under drought stress

白色箭頭顯示干旱脅迫下花朵萎蔫圖4 干旱脅迫下山茶和西洋杜鵑表型變化(比例尺=30 cm)White arrows show the withering of flowers under drought stressFig.4 Phenotypic changes of C. japonica and R. hybridum under drought stress (scale=30 cm)

2.2 山茶和西洋杜鵑花瓣和葉片光學栓塞脆弱性

在透射光下可以清晰地觀察到花瓣和葉片的導管網(wǎng)絡結構(圖5)。其中，山茶花瓣、西洋杜鵑花瓣、山茶葉片和西洋杜鵑葉片在脫水過程中分別拍攝了62.8、38、51.9和8.2 h后，所有的栓塞事件已完全呈現(xiàn)。通過ImageJ軟件分析初始栓塞發(fā)生時間為西洋杜鵑葉片1.9 h、山茶葉片27.4 h、西洋杜鵑花瓣27.6 h和山茶花瓣38.9 h；在西洋杜鵑和山茶葉片中，較大的葉脈內(nèi)顯示了不同顏色的疊加，說明在葉脈內(nèi)經(jīng)歷多次栓塞事件，根據(jù)水勢分配的顏色標簽，西洋杜鵑葉片、山茶葉片、西洋杜鵑花瓣和山茶花瓣在水勢分別為-2.62、-4.56、-2.83和-3.96 MPa時開始出現(xiàn)栓塞(圖5)。

圖5 自然干旱下山茶花和西洋杜鵑花瓣和葉片的光學圖像(左)和彩色圖譜(右)Fig.5 Optical image (left) and color map (right) of petals and leaves of C. japonica and R. hybridum under natural drought stress

根據(jù)擬合的栓塞脆弱性曲線，每個物種的葉片和花瓣的曲線大致遵循S型(Sigmoidal function)函數(shù)(圖6，A、B)，同一物種的相同組織中曲線具有很好的相似性，表明通過光學方法繪制的栓塞脆弱性曲線具有很好的重復性。此外，不同物種不同組織的脆弱性曲線幾乎沒有重疊，尤其是葉片組織。在自然干旱過程中，西洋杜鵑葉片栓塞形成迅速，脆弱性曲線更陡峭，西洋杜鵑葉片完全栓塞后，山茶葉片才開始出現(xiàn)栓塞(圖6，B)。同時，兩種觀賞植物葉片的P50值(發(fā)生50%栓塞時對應的水勢值)均小于花瓣，表明在干旱脅迫下花瓣組織先發(fā)生栓塞；西洋杜鵑花瓣和葉片的P50值分別為-3.24 MPa和-4.40 MPa，顯著高于山茶花瓣(-3.99 MPa)和葉片(-5.92 MPa)(圖6，C)，表明在干旱條件下西洋杜鵑花瓣和葉片比山茶花瓣和葉片更容易發(fā)生栓塞。

2.3 山茶和西洋杜鵑花瓣和葉片形態(tài)結構特征

植物在遭受干旱脅迫時，組織形態(tài)結構特征對其抗旱性具有重要影響。兩種觀賞植物花瓣和葉片的形態(tài)結構特征(厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織、海綿組織、葉脈密度、氣孔密度)測定結果(表1)顯示，山茶和西洋杜鵑間的花瓣厚度、上表皮厚度、下表皮厚度沒有顯著差異，而山茶花瓣的脈密度和氣孔密度均顯著大于西洋杜鵑花瓣；在葉片的形態(tài)結構中，山茶葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度、葉脈密度均顯著大于西洋杜鵑，氣孔密度顯著低于西洋杜鵑。

表1 山茶和西洋杜鵑花瓣和葉片的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of petals and leaves of C. japonica and R. hybridum

A和B中同一植物的3條曲線代表3個重復，不同小寫字母表示不同植物相同組織之間P50值在0.05水平差異顯著(P <0.05)圖6 山茶和西洋杜鵑花瓣(A)和葉片(B)的光學栓塞脆弱性曲線及P50值(C)The three curves of the same plant in Fig.A and B represent three repeats,and different normal letters indicate significant differences in P50 values between same tissues in different plants at 0.05 level (P <0.05)Fig.6 Optical embolism vulnerability curves of C. japonica and R. hybridum petals (A) and leaves (B) and P50 (C)

2.4 山茶和西洋杜鵑花瓣和葉片持水性

植物組織含水量和干物質量是反映植物水分盈缺和光合作用狀況的重要指標[25-26]。山茶和西洋杜鵑花瓣及葉片的單位面積含水量和單位面積干物質量測定結果(圖7)顯示，山茶花瓣和葉片的單位面積含水量和單位面積干物質量均顯著高于西洋杜鵑，表明抗旱性強的山茶葉片和花瓣含水量和干物質量較大。

不同小寫字母代表山茶和西洋杜鵑之間在0.05水平差異顯著(P <0.05)圖7 山茶和西洋杜鵑花瓣和葉片含水量(A)和單位面積干重(B)The different normal letters represents significant difference between C. japonica and R. hybridum at 0.05 level (P <0.05)Fig.7 Water content (A) and dry matter mass (B) of petals and leaves of C. japonica and R. hybridum

3 討 論

植物通常從土壤中吸收水分，土壤水勢是用于衡量土壤干旱程度及植物可利用水分的重要指標[27]。在土壤-植物-大氣連續(xù)體系統(tǒng)中，當土壤水勢降低于一定閾值時，土壤含水率快速下降[28-29]。在本研究中，西洋杜鵑和山茶兩種植物生長的土壤水勢在干旱早期(第0～6 d)雖有降低但變化不顯著，推測干旱9 d是土壤水分變化的閾值。盡管土壤水勢在干旱第9天顯著降低，但此時山茶的花瓣和葉片水勢未表現(xiàn)出顯著的變化，且山茶的花瓣和葉片表型未受到嚴重影響，表明它的抗旱性強于西洋杜鵑。

同時，水力分割理論認為，在干旱期間植物往往會先犧牲重要性較小和投資成本較小的器官來拯救對植物長期生存和繁殖至關重要的器官[30]。從本研究栓塞脆弱性曲線和P50值可以看出，兩種花卉植物的花瓣組織比葉片更脆弱，表明山茶和西洋杜鵑植物在干旱條件下優(yōu)先犧牲花瓣組織從而保存葉片組織，這與水力分割理論一致，因為與葉片相比，花瓣的投資成本更小。從不同組織栓塞發(fā)生時間來看，本研究中兩種花卉植物的花瓣發(fā)生栓塞的時間都比葉片延遲，但花瓣的P50高于葉片，因此，栓塞發(fā)生快慢不能作為評價植物組織抗旱性指標。

另外，本實驗結果表明，抗旱性強的山茶葉片厚度、上下表皮、柵欄組織和海綿組織都大于西洋杜鵑。厚的葉片儲水能力較強，而較厚的表皮能有效降低水分的蒸騰作用，同時在一定程度上避免光照對葉肉組織的灼傷[31-32]。發(fā)達的柵欄組織可增加水分從維管束到表皮間的運輸效率，增加葉肉細胞的表面積，從而保證植物光合作用對水分的需求[33]。大量的海綿組織利于植物與外界進行氣體交換，植物充分利用光照維持較高的光合速率[34]。這些有利于植物保水和節(jié)水的形態(tài)結構特征，緩解了植物在干旱環(huán)境下水分虧缺，延緩栓塞的形成，從而增強植物的抗旱能力。葉脈是葉片組織水分運輸?shù)闹饕ǖ繹35]，當葉脈發(fā)生栓塞時，部分未發(fā)生栓塞的葉脈繼續(xù)運輸水分，這與本研究發(fā)現(xiàn)的山茶花瓣和葉片中脈密度高于西洋杜鵑的結果相吻合。氣孔是植物水分散失的主要通道，與植物蒸騰作用、光合作用以及環(huán)境變化、氣候變化等密切相關[36-37]。前期研究表明，氣孔密度越大植物越抗旱，較高的氣孔密度能提高葉片光合效率，從而在干旱脅迫下能保持相對穩(wěn)定的光合速率，緩解干旱脅迫所帶來的光合損傷[38-41]。但本研究與前人研究結果相反，較抗旱的山茶葉片的氣孔密度低于西洋杜鵑。除氣孔密度外，山茶的葉片形態(tài)，如葉片厚度、上下表皮等都顯著大于西洋杜鵑，我們猜測山茶可能更多依賴葉片形態(tài)結構來提高植物抗旱性，而通過增加氣孔密度來提高植物的抗旱性的貢獻則不大。盡管在山茶花瓣中觀察到稀疏的氣孔，但山茶花瓣組織上的氣孔可能不是控制水分蒸騰和CO2進出的結構[42]；另外，有研究結論認為花瓣上的氣孔起到控制花瓣開閉的功能[43]。到目前為止，花瓣組織上的氣孔功能研究較少，它對花瓣栓塞脆弱性的貢獻仍需進一步探討。

此外，水力障礙是干旱脅迫期間植物死亡的主要決定因素[44]。在干旱脅迫下，木質部導管負責在負張力下將水分從土壤中提出來，補充植物組織因蒸騰作用散失的水分[45]。西洋杜鵑葉片和花瓣組織含水量越少，在干旱脅迫期間散失水分較快，木質部導管在強張力下運輸水分，增加了栓塞形成的風險。

4 結 論

栓塞脆弱性作為植物抗旱性的重要指標，山茶和西洋杜鵑花瓣和葉片在干旱過程中都發(fā)生栓塞。通過分析兩種植物花瓣和葉片栓塞脆弱性發(fā)現(xiàn)，山茶花瓣和葉片栓塞脆弱性小于西洋杜鵑。山茶和西洋杜鵑間的花瓣厚度、上下表皮厚度沒有顯著差異，而山茶花瓣的脈密度和氣孔密度均顯著大于西洋杜鵑花瓣；在葉片的形態(tài)結構中，山茶葉片厚度、上下表皮厚度、海綿組織厚度、葉脈密度均顯著大于西洋杜鵑，而氣孔密度顯著低于西洋杜鵑。山茶和西洋杜鵑的栓塞脆弱性與其組織形態(tài)結構有關，葉片厚度、上下表皮厚度、海綿組織厚度越厚,栓塞脆弱性越小。本實驗結果表明，在未來氣候逐漸變暖的趨勢下，可以優(yōu)先選擇山茶作為城市綠化的植物。