茶樹CsbHLH71基因克隆及轉錄活性分析

吳應奇，宋小鳳，鄧見田燁，白思蕾,3，李 娟,3，王坤波,3*

(1 湖南農業大學 教育部茶學重點實驗室，長沙 410128；2 湖南農業大學 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，植物功能成分利用省部共建協同創新中心，長沙 410128；3 湖南農業大學 農業農村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，長沙 410128)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]起源于中國西南地區，是世界廣泛種植的一種葉用經濟作物[1]。茶樹中積累的次生代謝產物對茶葉的品質具有十分重要的作用[2]。兒茶素是茶樹中一種主要的類黃酮次生代謝產物，是茶葉中造成苦、澀味的主要物質[3]。研究發現，向茶樹葉面噴施微生物肥，有利于提高茶葉中氨基酸含量，降低酚氨比，提升茶葉的感官品質[4]和產量[5]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種根際促生菌和有益內生菌，常被制成微生物菌肥用于農業生產[6]。然而，目前關于解淀粉芽孢桿菌微生物肥影響茶樹中兒茶素生物合成的分子調控機制尚不明晰。

轉錄因子(transcription factors)，也稱為反式作用因子，是一組能夠與靶基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性相互作用從而調控靶基因表達的蛋白質[7]。堿性螺旋環螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)是植物體內僅次于MYB的第二大類真核轉錄因子家族[8]，廣泛參與植物的生長發育[9]、次生代謝生物合成[10]、非生物脅迫響應[11]和新陳代謝[12]等過程。研究發現，bHLH蛋白在茶樹類黃酮次生代謝過程中扮演重要角色[13]，能調控茶樹類黃酮次生代謝產物如兒茶素的合成[14]，從而影響茶葉的感官品質。茶樹是一個遺傳性十分復雜的植物，轉錄因子在茶樹中的研究起步較晚，bHLH轉錄因子在茶樹體內轉錄調控的分子機理還不清晰。因此明確茶樹類黃酮代謝途徑中的分子機理、挖掘茶樹轉錄調控相關基因，對于闡明兒茶素生物合成的分子機制，進一步推動茶樹轉錄水平的代謝調控機制和推動特異性茶樹種質資源的開發利用具有重要意義[15]。

本研究以葉面噴施不同濃度微生物肥的茶樹鮮葉為原料，結合茶樹中兒茶素含量與轉錄組(RNA-seq)數據，篩選出了一個與兒茶素含量高度負相關的bHLH家族轉錄因子CsbHLH71。通過PCR克隆得到茶樹CsbHLH71轉錄因子的全長CDS序列，并利用生物信息學分析該基因的結構、理化特征、進化關系及轉錄活性等，為進一步探究bHLH轉錄因子調控茶樹中兒茶素生物合成的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘碧香早’茶樹種植于湖南農業大學長安基地，微生物肥生態液(甘肅尚農生物科技有限公司，白銀，甘肅，中國)有效成分為解淀粉芽孢桿菌EZ99，有效活菌數≥250億/mL。將微生物肥分別稀釋1 000(C1)和2 000(C2)倍，于夏季(6月)對統一修剪后的茶樹進行葉面噴施，共噴施3次，每次間隔7 d，對照組(CK)進行噴水處理。待新梢萌發后，采摘茶樹的一芽二葉葉片，迅速使用液氮冷凍處理，于-80 ℃儲藏備用。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹CsbHLH71基因CDS序列克隆利用Primer Premier 5.0設計CDS克隆引物(表1)，委托北京擎科生物科技有限公司進行引物合成。采用植物總RNA提取試劑盒提取‘碧香早’茶樹鮮葉總RNA，逆轉錄得到cDNA，以cDNA為模板克隆目的基因，送北京擎科生物有限公司測序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 茶樹CsbHLH71基因生物信息學分析利用NCBI在線工具對茶樹CsbHLH71蛋白氨基酸序列進行分析，在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL分別預測蛋白序列的二、三級結構。利用在線軟件ExPASy中的ProtParam tool工具分析蛋白的理化性質，TMHMM server V.2.0在線工具分析CsbHLH71蛋白的跨膜結構。通過在線網站NCBI中Blast查找與茶樹CsbHLH71蛋白同源序列，多序列比對采用DNAMAN軟件，并利用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。Cell-PLoc 2.0在線預測CsbHLH71蛋白定位情況。

1.2.3 茶樹CsbHLH71基因表達分析以‘碧香早’茶樹鮮葉總RNA逆轉錄合成的第一鏈cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(引物見表1)，以β-actin為內參基因，3次生物學重復，采用2-ΔΔCT法[16]分析CsbHLH71基因在不同處理中的相對表達量。

1.2.4 茶樹CsbHLH71蛋白的亞細胞定位為了驗證CsbHLH71蛋白的亞細胞定位情況，將其通過同源重組法構建到pEAQ-GFP載體上并導入農桿菌中，注射到本氏煙草葉片中，適宜條件下培養48～72 h后，通過熒光顯微鏡觀察GFP信號并拍照記錄。具體參照程美女[17]實驗方法。

1.2.5 茶樹CsbHLH71蛋白的轉錄活性分析采用酵母分析系統及DLR煙草瞬時表達試驗分析CsbHLH71蛋白的轉錄活性。1)酵母體內轉錄活性分析：將CsbHLH71基因構建到pGBKT載體上，將其轉入到酵母感受態中，涂布至SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His缺陷篩選培養基上，28 ℃培養2～3 d。2)煙草體內的轉錄活性分析：將CsbHLH71基因構建到35S驅動的pBD載體上，作為Effector質粒，Reporter質粒為35S驅動的REN。將構建好的pBD-CsbHLH71質粒轉入農桿菌中，將含有Reporter和Effector的農桿菌按1∶9的比例充分混勻，注射到本氏煙草，培養2～3 d，檢測兩種熒光素酶的比值(LUC/REN)。具體實驗操作參照羅勇[18]的方法。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsbHLH71基因的CDS克隆與生物信息學分析

對噴施濃度梯度微生物肥的‘碧香早’茶樹一芽二葉進行RNA-seq測序，對RNA-seq數據(未公開)進行差異基因篩選，發現CsbHLH71基因(TEA030725.1)與CK組相比，基因的表達量明顯上升，且與葉片中兒茶素含量高度負相關。因此，我們設計了CsbHLH71的PCR特異性引物，從‘碧香早’茶樹中克隆了該轉錄因子，擴增后得到約912 bp大小的片段。

ProtParam tool在線工具分析顯示，CsbHLH71基因編碼303個氨基酸，化學式為C1461H2371N419O455S15，蛋白分子量為33.6 kD，理論等電點為8.12，脂肪系數87.33，總平均親水指數(GRAVY)為-0.280，不穩定系數59.00，是一種不穩定的親水性蛋白。分析該基因編碼蛋白的氨基酸組成，發現Leu(10.3%)和Ser(8.9%)含量較多，Trp(0.3%)和Cys(2.3%)等含量相對較少，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)有34個，帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)有32個。

CsbHLH71蛋白跨膜結構分析表明，該蛋白的303個氨基酸都位于細胞膜，跨膜螺旋氨基酸殘基數量的期望值是0.538 08，跨膜螺旋數量為0，CsbHLH71蛋白不是跨膜蛋白。通過NCBI對氨基酸序列進行分析，發現CsbHLH71蛋白包含一個從101-160位的堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)保守結構域，屬于bHLH家族蛋白。

CsbHLH71蛋白的二級結構預測表明，此蛋白303個氨基酸包含47.52%無規則卷曲，40.59%α-螺旋，9.24%的延長鏈，2.64%β轉角(圖1，A)。使用SWISS-MODEL預測CsbHLH71蛋白的三維結構與二級結構預測的結果一致，該蛋白的三維空間結構主要是螺旋和卷曲(圖1，B)。

A(藍色.α螺旋；紅色.延伸帶；綠色.β轉角；紫色.無規則卷曲)圖1 CsbHLH71蛋白的二級結構(A)和三級結構(B)A(Alpha helix,extended strand,beta turn and random coil are represented by blue,red,green and purple,respectively)Fig.1 The prediction of secondary structure (A) and tertiary structure (B)

將CsbHLH71蛋白氨基酸序列上傳到NCBI數據庫進行Blast比對，發現CsbHLH71蛋白具有典型的bHLH結構域，與其他植物bHLH氨基酸序列相似，這表明不同植物bHLH氨基酸序列保守性較高，只有少部分的結構域發生了細微變異(圖2)。系統發育樹結果(圖3)顯示，CsbHLH71蛋白與中國獼猴桃變種、杜鵑花的親緣關系最近，而與櫟木、核桃的進化距離較遠。

CsbHLH71.茶樹；AcbHLH71-like.中華獼猴桃變種；DzbHLH71-like.榴蓮；JrbHLH71-like.核桃；PtbHLH71.毛果楊；PvbHLH71-like.黃連木；QlbHLH71-like.櫟木；RgRHGRI-protein.杜鵑花；VrbHLH71-like.河濱葡萄；VvbHLH71.葡萄圖2 CsbHLH71蛋白與其他物種氨基酸序列同源比對CsbHLH71.Camellia sinensis；AcbHLH71-like.Actinidia chinensis var.chinensis；DzbHLH71-like.Durio zibethinus；JrbHLH71-like.Juglans regia；PtbHLH71.Populus trichocarpa；PvbHLH71-like.Pistacia vera；QlbHLH71-like.Quercus lobata；RgRHGRI-protein.Rhododendron griersonianum；VrbHLH71-like.Vitis riparia；VvbHLH71.Vitis viniferaFig.2 Multiple alignment of CsbHLH71 protein with other bHLH71 proteins of other species

圖3 CsbHLH71蛋白與不同植物進化關系Fig.3 Phylogenetic relationships between CsbHLH71 protein and other species bHLH71 proteins

2.2 茶樹CsbHLH71基因表達分析

為驗證轉錄組中CsbHLH71基因的表達結果，我們利用qRT-PCR進行了驗證。結果(圖4)表明，在不同濃度微生物肥處理后，CsbHLH71基因表達水平顯著上調，但在1 000倍中上調趨勢更為顯著，說明微生物稀釋1 000倍處理對CsbHLH71基因表達更加明顯，這與轉錄組數據一致。

CK.對照，噴施蒸餾水；C1和C2分別指葉面噴施稀釋1 000倍和2 000倍的微生物肥；*與**分別表示與對照組(CK)相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)圖4 不同菌肥處理茶樹鮮葉中CsbHLH71基因的表達CK.Spraying with distilled water;C1 and C2.1 000 fold and 2 000 fold dilution;* and ** mean significant (P<0.05)and extremely significant (P<0.01) differences compared with CK,respectivelyFig.4 Expression of CsbHLH71 gene in leaves of Camellia sinensis under different microbial fertilizer treatments

2.3 茶樹CsbHLH71蛋白的亞細胞定位

Cell-PLoc 2.0在線預測表明CsbHLH71蛋白可能定位于細胞核。對浸染農桿菌的煙草葉片拍照記錄，發現陽性對照GFP整個細胞都能觀察到綠色熒光，而侵染了CsbHLH71-GFP的煙草只在細胞核中觀察到綠色熒光(圖5)，說明CsbHLH71蛋白定位于細胞核，屬于核蛋白。

圖5 CsbHLH71蛋白亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of CsbHLH71 protein

2.4 茶樹CsbHLH71蛋白的轉錄活性分析

在酵母體內(圖6，A)，轉化菌株在SD/-Trp缺素培養基上均正常生長，在SD/-Trp/-Ade/-His上只有陽性對照P-53的酵母菌株可以正常生長，且X-α-Gal活性檢測變藍，而陰性對照DBD-Empty和DBD-CsbHLH71的酵母菌株均不能正常生長，說明CsbHLH71蛋白在酵母內為抑制活性；在煙草體內(圖6，B、C)，pBD-CsbHLH71 LUC/REN數值比陰性對照pBD-Empty低。說明茶樹CsbHLH71蛋白在煙草體內表現出轉錄抑制活性，屬于轉錄抑制子。這些結果表明CsbHLH71蛋白在茶樹中可能通過抑制下游基因的表達行使功能。

3 討 論

茶樹次生代謝過程中轉錄因子起著重要調控作用[19]。例如，Gong等[20]發現日照強度通過影響bHLH、MYB、NAC等轉錄因子影響黃酮類化合物合成途徑中重要基因，如CHS、F3′5′H、SCPL和DFR的表達，導致茶葉中兒茶素在三個季節的含量不同。Liu等[21]發現遮陰降低了茶樹中兒茶素和黃酮醇的含量，與其生物合成相關的功能基因F3′H、FLS、ANS、ANR、LAR、DFR和CHS及轉錄因子MYB4、MYB12、MYB14和MYB111表達水平同時下調。

**表示與陰性對照比差異顯著(P<0.05)圖6 CsbHLH71蛋白在酵母(A)和煙草(B、C)的轉錄活性分析** means significant difference compared with contrast (P<0.05)Fig.6 Transcriptional activity analysis of CsbHLH71 protein in yeast cell assays (A) and tobacco (B,C)

本研究通過RNA-seq測序并從中篩選獲得一個茶樹CsbHLH71基因，生物信息學分析表明，CsbHLH71蛋白長度為303個氨基酸，含有一個59位的堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)保守結構域，屬于bHLH蛋白家族。氨基酸序列比對發現，在不同植物中bHLH家族氨基酸序列相似性較高，只有少數有細微變異，說明CsbHLH71蛋白在進化中相對保守，但不同植物的bHLH蛋白在進化過程中呈現出了多樣性。qRT-PCR分析表明，茶樹在微生物肥稀釋噴施處理下，CsbHLH71基因表達水平明顯高于未施肥的CK組，但在稀釋2 000倍處理中CsbHLH71基因的表達水平雖然較CK組有所上升，但不如1 000倍處理下效果顯著，說明高濃度的微生物肥可能促進茶樹CsbHLH71基因的表達。

亞細胞定位顯示CsbHLH71蛋白和大多數轉錄因子蛋白一樣定位于細胞核，是一個核蛋白，在細胞核內行使轉錄調控功能。研究發現，轉錄因子并非都是轉錄激活因子，也會阻遏目的基因的表達，起負調控作用。Xu等[22]在銀杏中發現了GbMYBF2負調控類黃酮合成，并通過遺傳轉化證實了它的功能。Luo等[23-24]在茶樹中發現CsbHLH62、CsWRKY31和CsWRKY48能夠抑制CsLAR、CsDFR和CCoAOMT，從而負調控EGCG3″Me的積累。在本研究中，我們發現CsbHLH71蛋白在酵母細胞中具有轉錄抑制活性，并通過在煙草的轉錄活性分析驗證了這一結果，證實了CsbHLH71蛋白具有轉錄抑制劑的功能，可能負調控茶樹類黃酮代謝合成產物兒茶素積累。CsbHLH71基因的表達水平與兒茶素含量呈負相關，猜測CsbHLH71基因可能參與了茶樹類黃酮代謝調控兒茶素的生物合成。通過分析本課題組前期運用高效液相色譜法檢測不同濃度微生物肥噴施處理下茶樹類黃酮代謝產物兒茶素含量發現，部分兒茶素合成相關功能基因的表達水平受到了明顯抑制。因此推測，CsbHLH71基因通過參與茶樹類黃酮次生代謝，影響兒茶素合成相關基因的合成通路，但其與茶樹兒茶素合成功能基因之間的調控關系還需要進一步研究。

研究發現，bHLH轉錄因子還能與MYB、WD40合作形成三元MBW復合體來參與調控次生代謝產物的合成。Zhao等[25]發現MBW三元復合體可控制黃酮類化合物合成途徑中的多個酶促步驟。Chen等[26]發現R2R3-MYB蛋白可以直接結合靶基因的啟動子或作用于MBW復合物以抑制花青素的生物合成。Liu等[27]發現茶樹中MBW復合體能調節花青素和原花青素的積累。通過分析兒茶素合成的一些關鍵功能基因啟動子發現，序列中包含大量可以與bHLH、MYB、WRKY等轉錄因子結合的元素，如G-Box、E-Box、W-Box等，推測CsbHLH71蛋白可能存在與其他轉錄因子蛋白之間相互作用，形成復合體共同調控兒茶素的合成。未來將繼續通過凝膠阻滯遷移實驗(EMSA)、染色質免疫共沉淀(CHIP-qPCR)等方法，對CsbHLH71基因進行深入研究，以揭示CsbHLH71基因調控兒茶素合成的分子機制。