陸地棉GhCSN6A基因克隆及低磷脅迫下的表達

卿桂霞，耿翡翡，梁穎穎，周俊江，張富厚，孟超敏*

(1 河南科技大學 農學院，河南洛陽 471000；2 洛陽市作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，河南洛陽 471000)

COP9信號復合體(constitutively photomorphogennic signalosome，CSN)是一種進化上保守的多亞基蛋白復合體，參與動植物的許多生理過程，包括蛋白質降解、DNA損傷反應和信號轉導[1]。主要在泛素蛋白酶體通路(ubiquitin proteasome system，UPS)中發揮著調節作用[2]，UPS是蛋白質進行高效特異性降解的主要途徑，其過程為目標蛋白首先被泛素三酶級聯反應，然后對靶蛋白進行泛素化修飾，最后由26S蛋白酶體催化將其降解[3-4]。在高等真核生物中典型的CSN蛋白由8個不同亞基構成，它們被命名為CSN1-CSN8，通常包含2個保守結構域，分別是MPN和PCI[5]。其中CSN5和CSN6包含MPN結構域，該結構域是由3條α螺旋和9條β線纏繞成β片層組成，具有識別信號因子，激活下游活動，調控生物學等主要功能[6-7]。COP9信號復合體亞基已從多種生物中克隆并分析，而且發現CSN在植物抵御逆境中具有重要作用。通過研究部分功能喪失突變體VTC1-1的CSN5B雙突變擬南芥，發現CSN5B通過26S蛋白酶體途徑降解GDP-甘露糖焦磷酸化酶(VTC1)，使植物抵抗非生物脅迫的關鍵因子抗壞血酸(AsA)含量升高，從而增強植物對環境脅迫的耐受性[8]；利用基因芯片技術篩選出缺鐵條件下的基因，并對水稻CSN6基因進行缺鐵脅迫表達模式分析，發現水稻CSN6基因能夠應答缺鐵脅迫[9]。

棉花是中國當今最主要發展的經濟作物之一，其種植產業在整個世界上始終處于領先地位，創造的經濟效益在中國國民人均生產要素總值中具有重要意義[10-11]。但是由于棉花吸收利用的磷素在土壤中主要以磷酸根的形式存在，土壤中的磷酸根極其容易被金屬陽離子和礦物質吸附固定或轉化成有機磷而不能成為有效磷，因此土壤有效磷的供應情況和棉花吸收磷素的能力是使棉花免遭受低磷脅迫危害，降低低磷脅迫給棉花生長、纖維品質和產量造成影響的關鍵因素[12-13]。在低磷環境下，植物經過長期的進化過程中會形成一系列的應答機制來調節其生理生化反應來應對低磷脅迫[14-16],從而減少缺磷對自身的傷害。因此，可以通過克隆棉花應答低磷脅迫過程中的關鍵基因，解析其脅迫響應及作用機制，從而來提高棉花對磷的利用效率。

本研究在前期利用基因芯片技術篩選出適磷與低磷脅迫下的高差異表達序列ES816317和陸地棉基因組數據庫的基礎上，以磷高效棉花品種陸地棉‘新陸早19’(Gossypiumhirsutum‘Xinluzao 19’)為材料進行基因克隆，并對該基因在不同組織及根系低磷脅迫下的相對表達水平進行分析，為深入研究棉花GhCSN6A的生物學功能奠定基礎，以期為棉花磷高效基因工程育種提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

選取自交留種中籽粒飽滿的‘新陸早19’種子用 70%酒精殺菌 30 min，沖洗干凈后泡種 24 h 至棉花露白，分別播種于沙土中和河南科技大學農學院試驗田。沙土中的棉花在28 ℃恒溫培養箱培養至四葉期左右用以植株總RNA的提取。在試驗田棉花花鈴期取根、莖、葉、花等4個組織迅速放入液氮中備用。

將棉花種子播種于含干凈濕潤細沙的塑料盆內，28 ℃恒溫培養箱(光照14 h、黑暗10 h)培養至棉苗三葉期，選擇長勢良好且一致的幼苗移至水培盆中，用 1/2 Hoagland 營養液培養1周后分為2個處理水平，即適磷處理(SP，1.0 mmol/L)和低磷處理(LP，0.01 mmol/L)，磷源采用KH2PO4，為保證K+的濃度一致，以1.0 mmol/L為標準，低磷營養液中以KCl補齊K+，其他營養成分含有2 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、2.5 mmol/L KNO3、0.5 mmol/L NH4NO3、1.4 mmol/L MgSO4·7H2O、1 μmol/L ZnSO4·7H2O、1 μmol/L MnSO4·H2O、0.1 μmol/L CuSO4·5H2O、0.01 mmol/L H3BO3、0.005 μmol/L (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.1 mmol/L EDTA-FeNa[17]。分別處理0、4、12、24和72 h后，選取3株生長一致的棉花植株，并混合取其根部組織，然后迅速置于液氮中，-80 ℃保存備用。每日調節營養液 pH，使其保持在 6.5 左右，每3 d更換1次營養液。

1.2 試驗方法

1.2.1 低磷脅迫差異表達序列延伸利用基因芯片技術篩選得到‘新陸早19’在低磷和適磷2種不同處理下差異表達序列ES816317，以ES816317為探針在NCBI網站的EST數據庫中檢索其相似序列，并利用DNASTAR的Seqman將所得到的相似序列(覆蓋率>50%，相似度>85%)進行拼接得到其重疊群，后續以所得拼接序列為探針繼續檢索與拼接，直至沒有新的相似序列出現，其所得才為結果序列，利用ORFfinder在線平臺查找開放閱讀框，并對目的基因進行克隆與分析。

1.2.2 陸地棉基因組DNA的提取取液氮速凍‘新陸早19’完整植株，迅速將其研磨成粉末轉移至離心管，然后利用CTAB法提取陸地棉‘新陸早19’的基因組DNA，并以1%的瓊脂糖凝膠對其進行檢測，最后-20 ℃保存備用。

1.2.3 總RNA提取及cDNA合成按照天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取棉株總RNA，然后利用超微量分光光度計測定RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。若RNA的質量符合要求，則根據HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將所提取的總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，用于后續實驗。

1.2.4 基因克隆與測序根據拼接所得到的GhCSN6A基因序列信息，利用軟件Primer 5.0設計其ORF上、下游引物(表1)，并分別以陸地棉‘新陸早19’的DNA及cDNA為擴增模板，進行目的基因的擴增，再以1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增檢測。將目的條帶的PCR產物與TOPO-T載體進行連接，轉化、菌液PCR檢測，然后目標條帶的菌液送至上海生工生物有限公司測序，并保留一些菌液。

1.2.5 生物信息學分析采用NCBI數據庫中的blastn和blastp分析GhCSN6A基因的核苷酸序列及編碼氨基酸序列的同源性，并使用DNAMAN對GhCSN6A與同源蛋白序列多重比對，使用在線工具ProtParam預測GhCSN6A蛋白的各種理化性質[18]；利用SOPMA對其二級結構進行預測。利用SWISS-MODEL和CD-Search分別對GhCSN6A蛋白進行三維結構同源建模和功能結構域的分析。使用SingalP 3.0和TMHMM 2.0分別預測其信號肽和跨膜螺旋結構域；其磷化位點和亞細胞定位分別由NetPhos3.1 Server和Plant-mPLoc進行預測。利用MEGA 5.0的鄰接法(neighbor-joining method)構建系統發育進化樹。

1.2.6GhCSN6A表達的qRT-PCR基于GhCSN6A基因全長序列及保守域的分析，使用 Primer5.0設計熒光定量 PCR 引物(表1)，GhActin作為內參基因。反應體系按照SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒說明配制，使用熒光定量PCR儀型號為CFX96，采用2-ΔΔCt算法計算目的基因相對表達量，利用Origin 9.0對數據進行統計分析并作圖。

表1 實驗所用引物Table 1 Application of primers in the experiment

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫差異表達序列延伸

通過BLAST檢索陸地棉EST數據庫，獲得ES816317相似的陸地棉ESTs，采用電子延伸的方法進行最大程度的序列延伸。然后利用NCBI上的ORF finder進行查找，發現拼接得到的序列全長為1 814 bp，開放閱讀框為88～1 035共948 bp，編碼315 個氨基酸。通過blastn及blastp檢索全長序列，將該基因命名為GhCSN6A。

2.2 基因克隆與序列分析

以‘新陸早19’的基因組DNA為模板，GhCSN6A-1F和GhCSN6A-1R及GhCSN6A-2F和GhCSN6A-2R兩對引物進行PCR擴增，得到的擴增產物如圖1的第1、2條帶，分別約為1 650 bp和1 780 bp，以‘新陸早19’總RNA反轉得到的cDNA為模板，GhCSN6A-F和GhCSN6A-R為引物進行擴增，得到的產物如圖1的第3條帶，約1 190 bp。利用在線工具GSDS對分別以DNA和cDNA為模板擴增得到的已拼接的序列進行分析，可發現該基因含有9個外顯子和8個內含子(圖2)。

圖2 GhCSN6A基因結構分析Fig.2 Analysis of GhCSN6A gene structure

2.3 GhCSN6A蛋白理化性質及結構分析

陸地棉GhCSN6A蛋白分子式為C1582H2491N435O471S11，相對分子量為35.49 kD，含32個酸性氨基酸(Asp+Glu)、30個堿性氨基酸(Arg+Lys)，理論等電點為6.70，疏水性總平均值為-0.217，不穩定系數為46.49，屬于親水性不穩定蛋白。蛋白質二級結構預測表明，其二級結構由α-螺旋(alpha helix，44.13%)、無規則卷曲 (random coil，38.10%)、延伸鏈(extended strand，15.87%)和β-折疊(Beta turn，1.90%)組成。GhCSN6A蛋白三維結構同源建模顯示，該蛋白包含COP9 信號體復合亞基 6，即COP9 信號體的晶體結構。利用CD-Search對GhCSN6A蛋白功能結構域進行分析，發現GhCSN6A蛋白屬于MPN或MOV34超家族，具有MPN_CSN6結構域，是 COP9 信號體的 8 個亞基之一，與三級結構得到的結果一致。TMHMM 2.0預測結果顯示，GhCSN6A蛋白無跨膜螺旋結構和信號肽。SignalP 3.0信號肽預測結果與TMHMM預測結果相同，即該蛋白無信號肽。NetPhos 3.1 Server預測結果顯示，GhCSN6A蛋白含有36個能被磷酸化的位點(超過閾值線)，其中包括Ser位點20個、Thr位點11個和Tyr位點5個，主要被unsp、PKC和cdc2等蛋白激酶磷酸化。GhCSN6A蛋白亞細胞定位預測，該蛋白定位于細胞核。

M.DL2000；1-2.DNA；3.cDNA圖1 GhCSN6A的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of GhCSN6A

2.4 GhCSN6A蛋白的同源比對及系統進化樹分析

以GhCSN6A蛋白與擬南芥的10個AtCSN蛋白構建系統發育進化樹，結果(圖3)顯示，GhCSN6A蛋白與擬南芥CSN6家族聚為一類，其中，與AtCSN6A蛋白相似性最高。從NCBI數據庫下載CSN6A的同源蛋白氨基酸序列，并利用DNAMAN 對陸地棉與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianaattenuata)、木槿(Hibiscussyriacus)的CSN6A蛋白序列進行多重序列比對，結果(圖4)顯示，蛋白序列的一致性達到90.93%，由此可得MPN_CSN6結構域有一定的保守性。用NCBI數據庫中BLASTp對GhCSN6A基因進行同源比對，結果顯示該基因與木槿CSN6A基因的相似性最高，達95.87%，與哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)CSN6A基因和榴蓮(Duriozibethinus)CSN6A基因的相似性均達93%。利用MEGA5對GhCSN6A和其他植物的CSN6A蛋白進行構建系統發育進化樹，結果(圖5)表明，不同物種的GhCSN6A蛋白分為2大分支，其中陸地棉GhCSN6A與在同一分支上的澳洲棉CSN6A、木槿CSN6A、榴蓮CSN6A和哥倫比亞錦葵CSN6A親緣關系較近。

圖3 基于GhCSN6A與擬南芥AtCSN蛋白氨基酸序列構建的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on amino acid sequences of GhCSN6A and Arabidopsis thaliana AtCSN protein

AtCSN6A.擬南芥；NaCSN6A.煙草；HsCSN6A.木槿；GhCSN6A.陸地棉圖4 GhCSN6A蛋白與同源蛋白氨基酸序列的多重比對結果AtCSN6A.Arabidopsis thaliana；NaCSN6A.Nicotiana attenuata；HsCSN6A.Hibiscus syriacus；GhCSN6A.Gossypium hirsutum L.Fig.4 Multiple alignment results of amino acid sequences between GhCSN6A protein and homologous proteins

圖5 基于GhCSN6A與其他植物的CSN6A蛋白氨基酸序列構建的系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on amino acid sequences of GhCSN6A and CSN6A proteins in other plants

2.5 GhCSN6A基因在不同組織及根部低磷脅迫處理的表達模式分析

以棉花的GhActin為內參基因，利用qRT-PCR技術檢測GhCSN6A基因在根、莖、葉和花等4個組織中的表達情況，結果(圖6)顯示，GhCSN6A基因在根、莖、葉和花中均有表達，在葉中的表達量最高，顯著高于花與莖中的表達量，其次是在根中的表達量較高，與莖中的表達量無顯著差異，在花中的表達量最低(P<0.05)。對陸地棉整株植物進行低磷脅迫，以不同處理時間的陸地棉根部組織為材料進行qRT-PCR，分析GhCSN6A基因響應低磷脅迫的情況。結果(圖7)表明，低磷處理0、4、12和24 h該基因的表達量比同期適磷處理的表達量低，低磷處理72 h時其表達量比適磷處理72 h的表達量高，是適磷處理的2倍。GhCSN6A基因在低磷脅迫0～72 h的總體變化趨勢為：相對表達量在0～4 h內上調，在4～24 h從一個較高的水平(4 h)降落到一個最低水平(24 h)，然后在72 h時又上升到最高水平。

不同字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)圖6 GhCSN6A基因在不同組織的相對表達分析Different letters indicate significant differences at 0.05 level (P<0.05)Fig.6 The relative expression of GhCSN6A gene in different tissues

3 討 論

COP9復合信號體在進化過程中是一種高度保守的蛋白復合物[19]。其中擬南芥COP9信號體的亞基6由一個家族的2個基因CSN6A和CSN6B編碼，其蛋白具有87%的氨基酸相似，并在N端區域包含MPR1p和PAD1p N端(MPN)結構域。CSN6蛋白與CSN5具有相似性，均屬于Mov34蛋白超家族[20-22]。本研究克隆的GhCSN6A基因編碼的蛋白含有MPN結構域，屬于Mov34蛋白超家族，與擬南芥、煙草、木槿的CSN6A蛋白序列相似性達90.93%，說明其在進化過程中具有一定的保守性。Gusmaroli等[23]發現，在擬南芥中，MPN結構域控制著CSN復臺體的組裝、復合體的穩定性及活性，并且還調控著一種泛素連接酶的穩定性。陸地棉GhCSN6A和擬南芥AtCSN6A蛋白具有相似的結構域，可能具有相似的功能。

*表示同期適磷與低磷處理間存在顯著差異(P<0.05)圖7 GhCSN6A基因在根部低磷脅迫不同時間的表達模式* indicates significant difference between suitable and low phosphorus treatment at 0.05 level.Fig.7 The relative expression analysis of GhCSN6A gene with low phosphorus treatment at different time points in roots

COP9信號復合體亞基已從多種生物中被克隆分析，其功能也被陸續發現，主要參與植物激素信號傳導、逆境脅迫應答、次生代謝活動等[24]。黃瓜綠斑駁花葉病毒CGMMV侵染黃瓜苗后，CsCSN5b基因表達量逐漸上升，說明該基因參與了病毒脅迫的應答機制響應CGMMV感染脅迫[25]；CSN6參與水稻缺鐵的早期反應，在缺鐵的早期，由于CSN6和CSN活性的下調，IDEF1在水稻中積累。IDEF1蛋白的積累有助于通過增加水稻中鐵吸收/利用相關基因的表達水平來克服缺鐵脅迫[26]。本研究發現該基因在‘新陸早19’葉中的表達量最高，根、莖次之，在花中表達量最低。王彥平等[27]發現低磷脅迫下棉花的生長素在根、莖、葉的含量變化明顯，尤其是葉中的含量變化最大。Stuttmann和Schwechheimer等[28-29]發現CSN與SCFTIRI互作參與植物生長素信號途徑。本研究低磷脅迫處理下的表達模式結果表明，在4～24 h這個時間段里，該基因的表達量從一個較高的水平(4 h)到一個最低水平(24 h)，然后又上升到最高水平(72 h)，其趨勢符合植物響應低磷脅迫反應的典型過程[9]。因為COP9復合體是作為一個整體的形式發揮作用的，通過與泛素系統相互作用來調控一系列的生物學功能。也就是說，生物體內的許多功能與泛素及COP9復合體有關。所以可以推測：在低磷脅迫的早期，生物體的功能會呈現出一種紊亂的狀態，導致很多功能被抑制，所以與這些功能相關的分子，如泛素、COP9復合體，也會受到相應的影響，因此表達量會明顯下降；但是當植物開始啟動低磷脅迫響應時，相應的基因就會得到表達，從而要啟動特殊的轉錄與調控機制，其中就包括COP9復合體在內的一些具有重要調控功能的基因就會加強表達，這個加強表達的時間就可能在72 h左右。因此，根據低磷脅迫表達模式的結果可推測：在72 h以后，COP9復合體的表達量明顯大于4～24 h，說明植物在72 h左右的時候已經進入一種響應低磷脅迫且相對穩定的狀態。在這個狀態之中，有很多基因需要受到特異性的轉錄或表達調控，從而應答低磷脅迫。

依據該基因的組織表達分析及根部低磷處理不同時間的表達模式分析結果，推測陸地棉GhCSN6A基因在調控低磷脅迫方面具有重要作用。但是GhCSN6A基因作為COP9信號復合體亞基之一，其具體的生物學功能及在植物應答低磷脅迫的調控機制仍需深入研究。后續將通過酵母雜交、VIGS和轉基因等功能驗證手段分析GhCSN6A基因如何在低磷脅迫中發揮作用，并觀察植株在低磷脅迫下的表現，從而揭示GhCSN6A基因在植物應答低磷脅迫的調控機制。