玉米生物鐘基因ZmPRR1-2的克隆及表達分析

董柯清，王雷立，劉青青，張嚴玲，王翠玲

(河南科技大學 農學院，河南洛陽 471023)

生物對晝夜交替中日照時間長短的周期性變化的響應被稱為光周期現象，普遍存在于動植物中。光周期途徑是植物開花的主要途徑之一，生物鐘是光周期途徑傳遞信號的重要一環[1-3]。中央振蕩器是生物鐘的核心部分，由LHY(late elongated hypocoty1)、CCA1(circadian clock associated 1)和偽應答調節蛋白家族(pseudo-response regulators，PRRs) 構成的負反饋調節環組成[4-5]，不僅能對從輸入途徑中傳遞的不同信號進行加工處理，還能經過一系列的反饋調節機制，在保持自身的生物節律的同時，將節律輸出給下游的節律調節基因GI等[6-7]。PRR基因家族作為生物鐘中央振蕩器的主要組成部分，在生物鐘系統中起著重要作用，目前擬南芥中共發現了5個PRRs成員，分別命名為PRR1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9，其中PRR1又被稱為TOC1(timing of cab expression 1)[8-9]。

TOC1在結構上有PRR家族均含有的REC和CCT結構域[10]，但是沒有PRR5、PRR7和PRR9的EAR結構域，因此其發揮轉錄抑制功能的機制與其他PRR家族成員不同[11]。研究發現TOC1與LHY和CCA1構成了中央振蕩器的核心負反饋調控環，在這個負反饋調控環中TOC1的表達量達到最高時CCA1/LHY能抑制TOC1的表達，而當CCA1/LHY表達量最高時TOC1又可以抑制CCA1/LHY的表達[12-15]。PRR家族成員在相互調控下呈現節律性表達，TOC1在黃昏后1～3 h達到表達高峰[8]。其作為生物鐘重要的晚間表達基因，隨著夜間蛋白質含量增加，還能夠抑制從早上到晚上表達的生物鐘基因[16-17]。目前在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中研究發現TOC1參與生物鐘循環并調控其下游基因表達[18-20]，能抑制PIFs介導的下胚軸伸長[20-22]，還與響應冷脅迫有關[22]。除此之外，水稻(Oryzasativa)中的TOC1也有相應冷脅迫的功能[23]，還發現OsTOC1有抗旱相關作用[24]。大豆(Glycinemax)中PRR1參與調控ABA信號及氣孔孔徑和非生物逆境反應等[25]。目前關于TOC1的研究主要集中在擬南芥和水稻中，其在玉米中的功能及調控關系還不清晰。通過全基因組鑒定發現玉米中存在2個PRR1的同源基因，將其命名為ZmPRR1-1和ZmPRR1-2[26]，其中前人克隆研究了ZmTOC1[27]，經鑒定該基因為ZmPRR1-1，關于ZmPRR1-2至今還無相關研究。

本研究以玉米骨干自交系‘黃早4’(HZ4)為材料，克隆了ZmPRR1-2基因，并對其進行生物信息學分析和表達規律分析，以期為揭示玉米生物鐘基因ZmPRR1-2在玉米光周期反應途徑中的調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

本研究所用試驗材料為玉米自交系‘黃早4’，種植于河南科技大學人工氣候室中，在玉米苗期選取長勢良好的幼嫩葉片組織提取RNA進行基因克隆。在玉米吐絲期，選取3株長勢一致的玉米分別取其根、莖、葉、花絲、未授粉果穗、葉耳、葉鞘及雄穗等組織，經過液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于進行組織特異性表達分析。晝夜節律表達分析所用的玉米材料分別種植于人工氣候室的長、短日照處理室中，短日照條件為9 h光照/15 h黑暗，長日照條件為15 h光照/9 h黑暗，溫度控制為(28±2)℃，相對濕度為40%～60%。前期試驗顯示‘黃早4’光周期誘導期是6～9葉期，本試驗選擇在第8片葉完全展開時選取長勢一致的3株玉米植株，從光照開始時采集葉片，每隔3 h取1次，每次約0.1 g，連續取樣48 h，各個時間點的葉片經過液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成采用TRIzol法提取玉米‘黃早4’的葉片及其他不同組織的總RNA，反轉錄用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TaKaRa，中國大連)進行，具體步驟參照說明書，用于qRT-PCR試驗的樣品所反轉錄的RNA量為1 μg。

1.2.2ZmPRR1-2基因的克隆使用Primer Premier 6.0軟件以已公布的玉米參考基因組B73序列(Zm00001d017241_T001)為模板設計獲得特異性引物(表1)。用反轉錄得到的cDNA作為模板進行ZmPRR1-2基因的cDNA克隆。PCR反應體系為：KOD OneTMPCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O 20 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火5 s，68 ℃延伸11 s，37個循環；最后4 ℃保存。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合要求的產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 特異性引物信息表Table 1 Specific primer sequences

1.2.3 生物信息學分析運用DNAMAN6.0軟件進行序列比對分析，利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸的理化性質，利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對ZmPRR1-2基因編碼氨基酸序列進行保守motif分析，利用NetPhos3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)在線軟件進行磷酸化位點預測，利用NPS@:HNN (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html) 預測蛋白質的二級結構，利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Plant-mPLocserver(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)進行跨膜結構域和亞細胞定位預測，利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析，利用NCBI的保守結構域數據庫CDD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)分析保守結構域。應用MEGA7.0軟件鄰近法構建系統發生樹。

1.2.4 組織特異性及節律表達分析分別提取各個樣本的總RNA并反轉錄成cDNA第一鏈，用qRT-PCR技術進行ZmPRR1-2基因的組織特異性和節律表達分析，內參基因為Ubiquitin，qRT-PCR試驗所用特異引物具體信息見表1。用熒光定量 PCR 試劑盒(全式金，北京)進行試驗，反應總體積為20 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，cDNA模板1 μL，無核酸酶水8 μL，2×PerfectStart Green qPCR Super Mix 10 μL。q RT-PCR反應程序為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，45個循環。每個處理均進行3次技術重復及3個生物學重復，得出的數據采用2-ΔΔCt法進行分析。

2 結果與分析

2.1 ZmPRR1-2基因的克隆及序列比對

cDNA的擴增結果與預測片段大小一致(圖1)，克隆得到的cDNA含有一個完整的開放閱讀框(ORF)，ZmPRR1-2基因CDS序列長度為1 554 bp，含有6個外顯子和5個內含子，共編碼517個氨基酸。比對發現ZmPRR1-2基因在‘黃早4’和B73中CDS區域大小相同，但是存在14處單堿基的差異，最終由于密碼子的簡并性造成2個玉米材料的ZmPRR1-2蛋白共有7個氨基酸不同。保守結構域預測發現，ZmPRR1-2基因所編碼的氨基酸序列含有1個REC結構域和1個CCT結構域，分別在氨基酸序列的第30～133個氨基酸區域及第442～483個氨基酸區域，REC結構域與CCT結構域之間的部分為IR(internal region)區域。結合氨基酸序列比對結果發現‘黃早4’和B73的ZmPRR1-2氨基酸序列在REC結構域中序列完全一致，高度保守，但在IR區域中有5個氨基酸的差異，在CCT結構域中有1個氨基酸的差異(圖2)。

M.Marker；H4.Huangzao 4圖1 ZmPRR1-2基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of ZmPRR1-2 gene

圖2 玉米自交系‘黃早4’和B73中ZmPRR1-2氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment of ZmPRR1-2 proteins in ‘Huangzao 4’ and B73

2.2 ZmPRR1-2蛋白的理化性質分析及結構預測

使用在線軟件ExPAsy對ZmPRR1-2基因所編碼的氨基酸進行理化性質分析，結果表明，‘黃早4’中ZmPRR1-2基因所編碼517個氨基酸，分子式為C2473H3910N734O796S29，總平均親水性系數為-0.603，屬于親水性蛋白，不穩定系數為49.45，屬于不穩定蛋白，其相對分子質量為57.59 kD，理論等電點為6.41。ZmPRR1-2蛋白中相對較多的氨基酸是絲氨酸(Ser，S)，占比11.6%，色氨酸(Trp，W)含量最少僅占0.8%(表2)。二級結構分析表明該蛋白主要以無規則卷曲和α-螺旋為主體結構，分別含有23.21%的α-螺旋、59.96%的無規則卷曲、13.35%的延伸鏈以及3.48%的β折疊。亞細胞定位預測結果顯示其定位于細胞核內，信號肽與跨膜結構域預測結果表明ZmPRR1-2蛋白不包含跨膜結構域和信號肽。磷酸化位點預測結果顯示ZmPRR1-2蛋白共有55處磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser，S)為最多(38個)，占比69.09%，蘇氨酸(Thr，T)次之(14個)，酪氨酸(Tyr，Y)最少(3個)，該結果也符合在真核生物中磷酸化主要發生在絲氨酸上這一結論[28]。

表2 ZmPRR1-2蛋白中的20種氨基酸含量表Table 2 The list of 20 amino acids in ZmPRR1-2 protein

2.3 多序列比對及系統進化分析

以本試驗克隆所得的氨基酸序列為模板，在NCBI數據庫進行Blast同源比對，將所得結果篩選后進行序列比對，PRR1蛋白在多個物種中的2個重要保守結構域REC和CCT的氨基酸序列比對結果(圖3)顯示，PRR1蛋白的REC和CCT結構域在不同物種中相對保守，特別是禾本科物種的PRR1蛋白保守性非常高。進一步系統進化關系分析表明，玉米ZmPRR1-2基因與同屬于禾本科黍亞科的高梁PRR1(Sorghumbicolor，XP_002452462.1)親緣關系最近(89.89%)，并且與谷子(Setariaitalica，XP_004953120.1)、水稻(Oryzasativa，BAD38854.1)、大麥(Hordeumvulgare，AEW48242.1)等禾本科作物處于同一進化分支中，表明PRR1基因進化過程中在禾本科內相對保守，而與雙子葉植物擬南芥(Arabidopsisthaliana,Q9LKL2.1)，及油棕(Elaeisguineensis，XP_010943377.1)、椰子(Cocosnucifera，EHA8587847.1)等棕櫚科植物親緣關系較遠(圖4)。

A.REC結構域的保守序列；B.CCT結構域的保守序列；Zm.玉米;Td.野生二粒小麥;Sb.高粱;Ph.黍;Si.谷子;La.高羊茅;Bt.馬甲竹;Tu.烏拉爾圖小麥;Hv.大麥;At.擬南芥;Zo.姜;Ma.小果野蕉;Ao.石刁柏;Ac.鳳梨;Pd.海棗;Eg.油棕;Cn.椰子;Os.水稻;Pm.糜子;Bd.二穗短柄草圖3 ZmPRR1-2蛋白的保守結構域的多序列比對A.Conserved sequence of REC domain;B.Conserved sequence of CCT domain;Zm.Zea mays;Td.Triticum dicoccoides;Sb.Sorghum bicolor;Ph.Panicum hallii;Si.Setaria italica;La.Lolium arundinaceum;Bt.Bambusa tulda;Tu.Triticum urartu;Hv.Hordeum vulgare subsp.vulgare;At.Arabidopsis thaliana;Zo.Zingiber officinale;Ma.Musa acuminata subsp.malaccensis;Ao.Asparagus officinalis;Ac.Ananas comosus;Pd.Phoenix dactylifera;Eg.Elaeis guineensis;Cn.Cocos nucifera;Os.Oryza sativa;Pm.Panicum miliaceum;Bd.Brachypodium distachyonFig.3 Multiple sequence alignment of conserved domain of ZmPRR1-2 and other PRR1-2

圖4 ZmPRR1-2蛋白的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of protein sequences of ZmPRR1-2 and other PRR1-2

2.4 不同組織表達分析

不同組織的表達分析結果(圖5)顯示：在玉米‘黃早4’植株的根、莖、葉、花絲、果穗、葉耳、葉鞘及雄穗這8個組織部位中，ZmPRR1-2基因的相對表達水平在葉片中最高，并顯著高于其他7個組織，在果穗和花絲相對較低，且顯著低于雄穗，推測玉米中ZmPRR1-2基因主要在葉片中進行表達并發揮功能，參與玉米光周期調控，并且該基因在玉米開花轉化過程中對雄穗發育和雌穗發育的調控功能存在差異。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)圖5 玉米 ZmPRR1-2基因的組織特異性表達分析Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.5 Tissue-specific expression analysis of ZmPRR1-2 gene

2.5 晝夜節律表達分析

對長/短日照條件下玉米‘黃早4’的ZmPRR1-2基因進行連續48 h的表達分析，結果(圖6)表明，ZmPRR1-2基因在兩種日照條件下均具有以24 h為一個周期的節律性表達規律。且在兩種光照條件下，在光照起始時分ZmPRR1-2的相對表達水平較低。短日照條件下于光照后3 h起始ZmPRR1-2基因的表達，在光照后12 h或黑暗后3 h達到表達高峰；長日照條件下在光照后6 h起始該基因的表達，于光照后15 h或光照剛剛結束時達到表達高峰，這也使得ZmPRR1-2基因的表達高峰在長/短日照處理下相差3 h(圖6)。該結果與前人對ZmPRR1-1的研究結論相一致[27]。

橫坐標的實心方框顯示黑暗處理時長，空心方框為光照處理時長圖6 玉米ZmPRR1-2基因的晝夜節律表達分析The solid box portion of the abscissa means the time that are dark,and the hollow box portion is lightedFig.6 Circadian rhythm expression of ZmPRR1-2 gene

3 討 論

植物生長發育受到生物鐘的嚴密調控，PRRs家族基因是生物鐘系統的重要組成部分中央振蕩器的核心組成部分，PRR1(TOC1)作為PRRs基因家族最重要的成員，與MYB家族成員LHY和CCA1組成中央振蕩器的核心負反饋環，是中心反饋環的關鍵組成要件，在植物光周期調控開花途徑中發揮著關鍵作用[29]。在擬南芥中，CCA1和LHY在清晨時由光激活表達，在黎明時表達量最高，LHY和CCA1蛋白與TOC1啟動子的黑夜元件(AAATATCT)相結合從而抑制TOC1在白天表達。隨后，早晨環中PRR9的表達由于TOC1被抑制而得到解除，PRR9/PRR7/PRR5依次積累，極大地抑制了CCA1的表達，隨著CCA1/LHY表達水平的下降，從而可解除對TOC1基因表達的抑制作用，TOC1表達量逐漸升高，傍晚表達量達到峰值[4,6]。TOC1基因表達量過高或過低時，會造成生物鐘周期變短或延長，TOC1過量表達的突變體中生物鐘紊亂，表明TOC1的節律表達和蛋白豐度對于維持生物鐘的穩定發揮重要作用，TOC1基因表達節律失衡會造成植物細胞周期紊亂、開花時間異常、甚至影響植物正常的生長發育[30-31]。本研究中玉米ZmPRR1-2基因的晝夜節律表達規律與擬南芥TOC1基因的表達高度一致，在光照開始時，由于CCA1和LHY蛋白對ZmPRR1-2基因的抑制作用，ZmPRR1-2基因的表達水平非常低。ZmPRR1-2蛋白的減少解除了其對PRR9基因的抑制作用，隨著PRR9蛋白的增加，反過來抑制了ZmCCA1基因的表達，因而逐漸解除了CCA1對ZmPRR1-2基因的抑制作用，ZmPRR1-2基因的表達量逐漸增加。本研究中在短日照條件下于光照開始3 h后ZmPRR1-2基因的表達量開始逐漸上升，而長日照條件下在光照開始6 h后ZmPRR1-2基因的表達量才開始逐漸上升，表明光周期的長短對解除CCA1對ZmPRR1-2基因的抑制作用有重要影響，至于是光照時間還是黑暗時間發揮更為重要的作用，需要進一步探索。韋小敏試驗結果表明暗間斷能提高ZmCCA1、ZmGI基因的表達量，而降低ZmCN8和hd6的表達水平[32]。因此可以推測長日照條件下相對較長的光照時間有利于ZmCCA1的表達，故而延長了其對ZmPRR1-2基因的抑制作用，以致于ZmPRR1-2基因的表達起始時間比短日照下推遲了3 h，進一步試驗驗證這一假說將是一個非常有意義的研究課題。

同源比對和系統進化結果顯示，玉米中ZmPRR1-2基因與高粱、水稻、烏拉爾圖小麥等禾本科植物親緣關系較近，序列一致性非常高，但是與這些作物不同的是，在玉米中PRR1基因的同源基因有2個，分別是ZmPRR1-1和ZmPRR1-2，分別位于第4和第5染色體，推測原因可能與玉米基因組在與高粱分化后，大約5～1 200萬年前經歷的一次四倍體化事件有關，玉米的四倍體化的歷史導致玉米基因組中直系同源基因的數量明顯高于其近緣系高粱和蜀黍族的其他核心作物[8,26]。生物鐘系統的調控網絡在生物鐘相關基因節律表達的動態變化過程中維持平衡，從而保持其功能的穩定性，如果這2個基因均在晝夜節律網絡中發揮作用，則玉米生物鐘調控網絡可能會變得更加復雜。那么ZmPRR1-1和ZmPRR1-2是否會出現功能分化或者功能冗余？它們如何參與玉米生物鐘系統的調控網絡，仍有待闡明。

LHY和CCA1蛋白對TOC1基因的抑制作用的分子機制已經闡述的非常清楚[13]。然而關于TOC1對CCA1和LHY的抑制作用的分子機制，至今尚不明晰。與其他PRR家族成員不同的是，PRR9、PRR7和PRR5蛋白能通過其EAR結構域與TOPLESS和HDA6(histone deacetylase 6)形成一個復合體，結合到CCA1和LHY的啟動子上抑制其轉錄，而TOC1沒有EAR結構域，不能直接與CCA1的啟動子結合從而抑制其轉錄[11]。本研究結果表明ZmPRR1-2蛋白含有REC和CCT兩個重要結構域，符合其作為PRR家族成員的基本結構特征，而其IR區間與擬南芥TOC1一樣不含有其他家族成員所共有的重要基序EAR-motif[20]。Pruneda-Paz等[15]的研究表明TOC1可以與TCP轉錄因子CHE(CCA1 hiking expedition)互作，而CHE能結合到CCA1的啟動子的TBS位點(GGTCCCAC)，從而抑制CCA1的表達。又有研究表明TOC1可通過其CCT結構域的T1ME元件(TGTG)直接結合到CCA1和LHY的啟動子上從而抑制二者的轉錄[20]。由此可見，TOC1對CCA1和LHY的抑制作用的分子機制非常復雜，到底ZmPRR1-2是否能通過其CCT結構域直接結合到ZmCCA1和ZmLHY的啟動子上，抑或是通過與CHE蛋白的互作間接地結合到ZmCCA1和ZmLHY的啟動子上，從而抑制其表達，需要進一步深入研究。而且，玉米中存在ZmPRR1-1和ZmPRR1-2兩個TOC1的同源基因，使得問題更為復雜，這兩個基因如何與CCA1和LHY相互抑制是玉米生物鐘調控機制研究中需要解決的關鍵問題。

綜上所述，本研究以玉米自交系‘黃早4’為試驗材料,擴增獲得玉米PRR家族轉錄因子ZmPRR1-2,并分析了其組織性特異表達特征和不同光周期環境下的晝夜表達規律，初步驗證了其晝夜節律表達節律與擬南芥TOC1高度一致，推測其在玉米光周期調控開花途徑中發揮重要作用，為揭示其在玉米生物鐘中的分子功能奠定了基礎，但是ZmPRR1-2與CCA1和LHY的相互反饋抑制調控的分子機制需要進一步深入研究。