放射性同位素示蹤法研究氟啶蟲(chóng)酰胺在蛋雞中的排泄

王澤華，陳東宇，孫 慧，王 帥，王喜樂(lè)，黃 偉，胡文巖，劉永利，余 洋

（沈陽(yáng)沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司安全評(píng)價(jià)中心，沈陽(yáng) 110141）

氟啶蟲(chóng)酰胺（Flonicamid）是由日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社發(fā)現(xiàn)的吡啶酰胺（或煙酰胺）類殺蟲(chóng)劑[1]，主要用于防治農(nóng)作物上的刺吸式口器害蟲(chóng)，尤其對(duì)蚜蟲(chóng)高效。氟啶蟲(chóng)酰胺是一種選擇性殺蟲(chóng)劑，對(duì)蜜蜂、草蛉、寄生蜂、瓢蟲(chóng)等天敵昆蟲(chóng)表現(xiàn)出很好的安全性[2]。放射性同位素示蹤技術(shù)是以放射性核素作為示蹤劑對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記并檢測(cè)的微量分析方法，該技術(shù)具有示蹤、直觀、簡(jiǎn)便、痕量和準(zhǔn)確等特點(diǎn)[3-5]。人們利用各種現(xiàn)代化分析測(cè)試手段開(kāi)展了大量研究工作。然而，在諸多研究分析方法中，放射性同位素示蹤技術(shù)以獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為國(guó)際公認(rèn)的研究藥物代謝及處置的最有效手段之一[6-10]。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質(zhì)，可以用現(xiàn)代放射性檢測(cè)儀器，如液體閃爍計(jì)數(shù)分析儀和在線同位素檢測(cè)儀等，追蹤藥物在體內(nèi)的分布、含量變化及排泄等[11]；通過(guò)將示蹤劑引入動(dòng)物體內(nèi)，研究其在動(dòng)物體內(nèi)吸收、分布、代謝及消減等動(dòng)態(tài)過(guò)程中的規(guī)律。目前對(duì)氟啶蟲(chóng)酰胺的研究大多集中于環(huán)境、作物中的殘留與毒性安全評(píng)價(jià)，而有關(guān)其在動(dòng)物體內(nèi)的研究相對(duì)較少，至今未見(jiàn)在蛋雞排泄的研究報(bào)道。因此本研究采用14C標(biāo)記氟啶蟲(chóng)酰胺，研究其在蛋雞體內(nèi)的排泄，為進(jìn)一步研究該物質(zhì)的毒理作用機(jī)制和毒物安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

99.2%氟啶蟲(chóng)酰胺原藥，國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（沈陽(yáng)）；14C標(biāo)記氟啶蟲(chóng)酰胺（比活度：51.74 mCi/mmol），無(wú)錫貝塔醫(yī)藥科技有限公司；閃爍液，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），Sigma-Aldrich公司；明膠膠囊，浙江天龍膠丸有限公司。

Tricarb-2910型液體閃爍計(jì)數(shù)分析儀（LSC），配備QuantaSmart 4.00操作軟件，美國(guó)Perkin Elmer儀器公司；高效液相色譜-在線同位素檢測(cè)儀（HPLC-ARC），配備Empower 3與ARC101 2.8.0.142B操作軟件，美國(guó)Waters與ARC儀器公司；Harvey OX-501型生物氧化燃燒儀，美國(guó)Harvey儀器公司；超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平、Milli-Q超純水機(jī)，德國(guó)Sartorius公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司。

海蘭蛋雞，遼陽(yáng)縣柳壕鎮(zhèn)北方牧業(yè)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

動(dòng)物室溫度為24.0～28.0℃，濕度為30%～71%，自動(dòng)控制光照，12 h光照，12 h黑暗。試驗(yàn)動(dòng)物使用過(guò)程完全接受沈陽(yáng)沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司動(dòng)物管理委員會(huì)（IACUC）的監(jiān)督。試驗(yàn)前所有蛋雞飼養(yǎng)于家禽動(dòng)物房中不銹鋼飼育籠內(nèi)，蛋雞產(chǎn)蛋期配合飼料喂養(yǎng)。飼料及飲用水不包含任何影響試驗(yàn)結(jié)果的污染物，試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水，每日飼喂2次。

試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組和給藥組，空白對(duì)照組1只蛋雞，給藥組10只蛋雞。采用膠囊經(jīng)口方式給藥，給藥劑量設(shè)定為10 mg/kg飼料，每只動(dòng)物每天給藥量為1.12 mg，即每天經(jīng)口給予膠囊1粒，連續(xù)給藥7 d；空白對(duì)照組每天經(jīng)口給予安慰劑（空白膠囊）。

1.3 給藥溶液的配制

精確稱?。?4C］氟啶蟲(chóng)酰胺40.00 mg于25 mL的容量瓶中，加入未標(biāo)記氟啶蟲(chóng)酰胺60.07 mg，用甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為4 mg/mL的供試藥劑溶液，貼好標(biāo)簽，備用。

1.4 給藥膠囊的制備

根據(jù)每只動(dòng)物每天的給藥量，結(jié)合給藥溶液的質(zhì)量濃度計(jì)算每個(gè)膠囊所需試藥溶液的體積；移取280μL的試藥溶液于明膠膠囊中，在通風(fēng)櫥中用氮?dú)獯蹈扇軇┖蠓饪?，共制?2粒試藥膠囊，將膠囊置于塑料瓶中，貼好標(biāo)簽，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 給藥膠囊中試藥的穩(wěn)定性考察

氟啶蟲(chóng)酰胺試藥溶液配制完成后，用甲醇稀釋為8μg/mL的溶液，取2個(gè)平行樣品，采用HPLC-ARC測(cè)定其放射化學(xué)純度；在最后1次給藥完成后，將剩余的膠囊打開(kāi)1粒，置于50 mL的離心管中，加入15 mL甲醇，超聲提取3次，每次提取10 min。合并3次的提取液于50 mL的容量瓶中，甲醇定容，稀釋至接近的濃度，測(cè)定稀釋液（平行2個(gè)樣品）的放射化學(xué)純度，通過(guò)比較2次的測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)給藥膠囊中試藥的穩(wěn)定性。按式（1）計(jì)算偏差。2次測(cè)定的放射化學(xué)純度偏差不超過(guò)±10%，則符合試驗(yàn)檢測(cè)要求。

1.6 同位素稀釋試藥比活度的測(cè)定

取適量供試藥劑溶液，用甲醇稀釋成4μg/mL，取2個(gè)100μL平行樣品，分別加入10 mL Ultima Gold閃爍液后，采用LSC測(cè)定放射性活度濃度。按式（2）計(jì)算未標(biāo)記供試藥劑的比活度。

式中：A為測(cè)定活度，Bq；V為量取體積，μL；C為質(zhì)量濃度，mg/mL，a為稀釋后比活度，Bq/mg。

1.7 總放射性殘留與物質(zhì)平衡回收率試驗(yàn)

1.7.1 樣品的采集及儲(chǔ)藏

在給藥期間，每日上午給藥前和下午各收集雞蛋1次，空白組每天收集的雞蛋去殼后，冷凍保存在-20℃的冰箱中；將下午收集的給藥組10只雞蛋去殼，與第2天上午收集的雞蛋混合作為同一天的樣品，冷凍保存在-20℃的冰箱中。第7次給藥后，動(dòng)物宰殺前收集的雞蛋作為第7 d的樣品；稱重記錄每天雞蛋樣品的重量，冷凍保存在-20℃的冰箱中。

每天給藥前收集空白組與給藥組蛋雞的排泄物，將相同時(shí)間段的給藥組10只蛋雞的糞便樣品混合，末次（宰殺前）收集后用80%甲醇-水清洗糞盤(pán)，將給藥組10只蛋雞的清洗液混合。記錄每天糞便及末次清洗液的重量，冷凍保存在-20℃的冰箱中。

1.7.2 樣品處理

雞蛋：雞蛋樣品解凍，混勻；稱取0.25±0.000 5 g樣品于閃爍瓶中，每個(gè)樣品2個(gè)平行；加入0.8 mL的超純水，混勻后，加入20 mL的Ultima Gold閃爍液，利用液體閃爍計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行總放射性殘留的分析。

糞便清洗液：樣品解凍，混勻；稱取0.5±0.000 5 g樣品于閃爍瓶中，每個(gè)樣品2個(gè)平行；加入10 mL的閃爍液Ultima Gold，利用液體閃爍計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行總放射性殘留的分析。

糞便：樣品解凍，將不同時(shí)間段的空白糞便樣品混合，給藥組各時(shí)間段的糞便樣品單獨(dú)處理，向糞便樣品中加入50%的乙腈-水溶液，浸泡30 min后勻漿；混勻后稱重，記錄各時(shí)間段勻漿液的重量。稱取勻漿液樣品約0.5±0.000 5 g于燃燒盤(pán)中（2個(gè)平行樣品），隨后置于70℃烘箱中烘干；烘干后的樣品進(jìn)行氧化燃燒，生成的[14C]CO2經(jīng)Carbo-Sorb E與Permafluor E+（3∶5，V/V）混合閃爍液吸收，利用液體閃爍計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行總放射性殘留的分析。

1.7.3 總放射性殘留與物質(zhì)平衡回收率分析

根據(jù)液體閃爍計(jì)數(shù)分析儀分析結(jié)果，按式（3）～（6）分別計(jì)算回收量、樣品總殘留量、回收量占比、平衡回收率。

式中：m回收為回收量，mg；A試樣、A空白分別為試樣和空白樣品的放射性活度測(cè)定值，Bq；m試樣為測(cè)定量，g；a為稀釋后比活度，Bq/mg；C樣品為樣品總殘留量，mg/kg；m樣品為樣品量，mg。每天給藥量，mg/(只·d)。

2 結(jié)果與分析

2.1 給藥膠囊的穩(wěn)定性分析

給藥前藥溶液放射化學(xué)純度平均值為99.9%，給藥結(jié)束時(shí)膠囊提取液放射化學(xué)純度平均值為100%，2次測(cè)定的放射化學(xué)純度偏差為0.101%，說(shuō)明在給藥過(guò)程中膠囊中的供試物質(zhì)穩(wěn)定。2次平行樣品給藥前后的HPLC-ARC在線放射性譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 給藥前后給藥溶液的HPLC-ARC在線放射性譜圖

2.2 給藥溶液同位素稀釋后的比活度

根據(jù)給藥溶液的測(cè)定濃度計(jì)算出2個(gè)平行樣品的放射性活度濃度分別為10 490 000、10 426 167 Bq/mL，根據(jù)放射性活度濃度及質(zhì)量濃度計(jì)算經(jīng)未標(biāo)記氟啶蟲(chóng)酰胺稀釋后的給藥溶液比活度分別為2 622 500、2 606 542 Bq/mg，平均值為2 614 521 Bq/mg（表1）。此處的給藥溶液同位素稀釋后的平均比活度用于物質(zhì)平衡回收量的計(jì)算。

表1 給藥溶液同位素稀釋后的比活度

2.3 總放射性殘留與物質(zhì)平衡回收率

試驗(yàn)結(jié)果表明，雞蛋樣品的殘留量為0.239～1.570 mg/kg，氟啶蟲(chóng)酰胺的回收量為0.107～0.597 mg，總回收量為2.364 mg，占總給藥量的3.01%；糞便樣品的殘留量為4.73～12.70 mg/kg，氟啶蟲(chóng)酰胺的回收量為5.08～16.30 mg，總回收量為69.58 mg，占總給藥量的88.8%；糞便清洗液樣品的殘留量為0.756 mg/kg，氟啶蟲(chóng)酰胺的回收量為0.675 mg，占總給藥量的0.861%（表2）。根據(jù)以上雞蛋、糞便和糞便清洗液樣品的回收率結(jié)果，可以計(jì)算給藥氟啶蟲(chóng)酰胺后受試物質(zhì)的總物質(zhì)平衡回收率為92.7%。由此可以發(fā)現(xiàn)氟啶蟲(chóng)酰胺在蛋雞體內(nèi)主要通過(guò)糞便排泄，雞蛋中的排泄量較低。

表2 雞蛋、糞便和糞便清洗液樣品的總放射性殘留與物質(zhì)平衡回收率

3 結(jié)論

本研究利用放射性同位素示蹤技術(shù)研究氟啶蟲(chóng)酰胺在蛋雞體內(nèi)的排泄，通過(guò)雞蛋、糞便及清洗液中回收率結(jié)果可以得出，氟啶蟲(chóng)酰胺主要通過(guò)糞便排泄，雞蛋中的殘留量較少。本研究考慮蛋雞排泄后，糞盤(pán)上會(huì)有殘留，用80%甲醇-水充分清洗獲得糞便淋洗液并進(jìn)行測(cè)定，以保證總物質(zhì)回收率計(jì)算的準(zhǔn)確性。蛋雞給氟啶蟲(chóng)酰胺7 d后總回收率為92.7%，說(shuō)明放射性物質(zhì)在蛋雞體內(nèi)其他組織中分布較少?？偽镔|(zhì)平衡回收率的研究結(jié)果也為氟啶蟲(chóng)酰胺在蛋雞體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究奠定基礎(chǔ)。該方法是跟蹤農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物最有效的手段，能準(zhǔn)確定量地測(cè)定農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物，追蹤農(nóng)藥的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變[12]。利用同位素標(biāo)記化合物的示蹤作用，能夠在保證生物樣品原有屬性的同時(shí)，快速精確地得到原始總殘留，為合理使用農(nóng)藥提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。