QuEChERS/高效液相色譜－串聯質譜法測定護膚品中的21種麻醉劑

楊建英，朱 虹，徐 寧，陳曉紅，陳 慶，肖 珩

（廣東省汕頭市質量計量監督檢測所，廣東 汕頭 515041）

隨著我國經濟的高速發展和人們生活水平的日益提高，護膚品已成為必不可少的日用品。護膚品種類豐富，由于具有祛斑、祛痘、修護等功效，一直備受消費者青睞。臨床上常用的利多卡因、丙氧卡因等麻醉劑，可暫時使神經沖動被可逆性地阻斷，使局部疼痛、瘙癢在人的神志清醒狀態下短暫消失，因而可能被添加于宣稱具有祛斑、祛痘、修護、舒緩等功效的護膚品中，起到使面部肌膚短暫麻痹，痛感暫時消除的效果。但其能引起局部麻醉藥全身毒性（LAST）［1］和心臟毒性，消費者長期使用可能對身體健康造成危害。麻醉類藥品已被《化妝品安全技術規范（2015版）》［2］列入化妝品禁用原料目錄中。然而，隨著醫學水平的不斷發展，麻醉類藥物種類遠不止7種，常用的還有美索卡因、丙氧卡因、丙胺卡因等多種麻醉類藥物。為進一步加強護膚品的安全監管，保障消費者安全，應擴大麻醉類藥物的檢測范圍。近年來關于麻醉劑的檢測方法主要有毛細管電泳法［3－4］、氣相色譜法［5］、氣相色譜－質譜法［6］、離子色譜法［7］、液相色譜法［8－12］、液相色譜－串聯質譜法［13－18］等，主要涉及農產品、化妝品、藥物、血漿、唾液、外用成人用品、醫療美容產品等。其中液相色譜－串聯質譜法具有選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強等特點，目前已成為高通量分析最主要的檢測手段。已報道的液相色譜－串聯質譜測定多種麻醉劑的研究大多采用含C18填料的色譜柱以反相模式分離化合物，往往會出現色譜保留與質譜響應難以兼顧的情形。

與以往報道的方法不同，本文以QuEChERS為前處理手段，創新性地采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色譜柱配合高效液相色譜－串聯質譜法（HPLC－MS/MS）對護膚品中的21種麻醉劑進行測定，既增強了目標組分的保留，又提升了正模式下的響應，實現了分離度與靈敏度的兼顧，為液質聯用分析麻醉劑這類堿性化合物提供了一種新思路。本方法的建立可為護膚品中違禁使用的麻醉類藥物分析提供技術支持，提高護膚品安全風險的監控水平。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500液相色譜－質譜聯用儀（美國AB SCIEX公司）；ME 204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；pH計（PHS－3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司）；Multi Reax旋渦振蕩器（德國Heidolph公司）；SB25－12DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3－18KS高速離心機（德國Sigma公司）。

標準物質：普魯卡因胺、普魯卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、三卡因、甲哌卡因（純度 ≥98%，壇墨質檢科技股份有限公司）；布比卡因、羅哌卡因、鹽酸辛可卡因、丙胺卡因（純度 ≥ 83%，曼哈格（上海）生物科技有限公司）；鹽酸普莫卡因、布他卡因、利索卡因、鹽酸氯普魯卡因（純度 ≥ 98%，天津阿爾塔科技有限公司）；可卡因（1 mg·mL?1，美國Cerilliant公司）；美索卡因、丁氧卡因、丙美卡因（純度 ≥ 98%，加拿大ECO公司）；阿米卡因（純度99.8%，廣州佳途科技股份有限公司）；鹽酸丙氧卡因（純度97.0%，加拿大TRC公司）。

試劑與材料：甲醇、乙腈（HPLC級，瑞典Oceanpak公司）；甲酸（HPLC級，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲酸銨、乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；QuEChERS鹽析試劑包（含1.5 g乙酸鈉和6.0 g無水硫酸鎂）、QuEChERS凈化試劑包（含400 mg十八烷基鍵合硅膠（C18）、400 mg N-丙基乙二胺（PSA）、1 000 mg無水硫酸鎂）（美國Agilent公司）；實驗用水為超純水，由arium mini plus超純水器（德國Sartorius公司）制備；針式過濾器（0.2 μm，PTFE（親水性），賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.2 實驗步驟

1.2.1樣品預處理準確稱取均勻試樣0.5 g（精確至0.001 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，充分渦旋分散后，準確加入10 mL乙腈（含1.0%甲酸，體積分數，下同），渦旋提取1 min，超聲提取20 min后，加入鹽析試劑包（含1.5 g乙酸鈉和6.0 g無水硫酸鎂），振搖1 min，以5 000 r·min?1離心5 min。移取5 mL上清液于15 mL聚丙烯離心管中，加入凈化試劑包（含400 mg C18、400 mg PSA、1 000 mg無水硫酸鎂），渦旋混勻1 min，以5 000 r·min?1離心5 min，吸取上清液過0.2 μm PTFE濾膜，待分析。

1.2.2標準溶液配制取適量標準物質，用甲醇溶解稀釋，分別制備成100 μg·mL?1的標準儲備溶液。取適量單標儲備液，用甲醇逐級稀釋成質量濃度分別為1 000 ng·mL?1和100 ng·mL?1的混合標準中間液。稱取與該待測樣品基質類型相同的空白樣品0.5 g（精確至0.001 g）6份，分別加入適當濃度的混合標準中間液，按“1.2.1”步驟處理，配制成質量濃度為0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100 ng·mL?1的系列基質標準工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱（150 mm × 2.1 mm × 3 μm，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；柱溫：40 ℃；進樣體積：2 μL；流動相：A相為20 mmol·L?1甲酸銨溶液（用甲酸調至pH 4.0），B相為乙腈（含0.035%甲酸），流速為0.3 mL/min。梯度洗脫條件：0 ~ 1.0 min，10% B；1.0 ~ 6.0 min，10% ~ 60% B；6.0 ~ 8.0 min，60% B；8.0 ~ 9.0 min，60% ~ 90% B；9.0 ~ 11.0 min，90% B；11.0 ~ 12.0 min，90% ~ 10% B；12.0 ~ 15.0 min，10% B。

1.3.2質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正模式；采集方式：多反應監測（MRM），離子源噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源加熱溫度：600 ℃；氣簾氣（CUR）壓力：0.207 MPa；霧化氣（GAS1）壓力：0.414 MPa；加熱輔助氣（GAS2）壓力：0.379 MPa；其他質譜參數見表1。

表1 21種麻醉劑的質譜參數Table 1 MS parameters of the 21 anesthetics

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1色譜柱的選擇本研究中的21種麻醉劑多為中性或堿性物質，目前已報道的液相色譜－串聯質譜方法［13－18］較多采用C18色譜柱以反相模式分離化合物。文獻［13，15，17］通過在流動相中添加0.1%甲酸，在正模式下增強了電離效果，但會在一定程度上導致麻醉劑的色譜保留減弱，部分化合物（如普魯卡因胺、普魯卡因）在1 min內出峰，而目標化合物出峰過早易受到樣品基質的干擾；文獻［14］在流動相中添加氨水提高流動相pH值以增強麻醉劑的色譜保留，但會抑制正模式的響應，為達到合適的方法檢出限，需使用離子淌度差分質譜提高方法的靈敏度。因此，液相色譜－串聯質譜方法在分析堿性化合物時，會出現色譜保留與質譜響應難以兼顧的情形。此外，流動相pH值較低或較高，易對液相色譜系統管路造成腐蝕、磨損，對液相色譜管路耐受性的要求也會更高。

本研究采用的Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱能夠在單一鍵合相上提供多種保留機制，選擇性與C18反相色譜柱互補。該色譜柱的鍵合相為帶有羧基末端的疏水烷基鏈鍵合硅膠，疏水烴鏈提供反相保留（RP），羧基端基提供弱陽離子交換（WCX），適用于含伯仲叔胺及季銨結構、有機胺類、含氮雜環結構等堿性化合物的分析［19－20］。普魯卡因胺的結構式中含苯環、伯胺、仲胺和叔胺等官能團，酸度系數pKa為9.24，該堿性化合物在傳統反相色譜柱上的保留較弱，出峰時間接近死時間［13，15，17］。本方法使用Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱分析此類堿性化合物時，選擇較為“溫和”的流動相條件（pH值為3.0 ~ 6.5），該色譜柱的羧基端基與含氮官能團進行離子交換，疏水烴鏈與苯環進行反相保留，使得普魯卡因胺的保留顯著增強，岀峰時間在4 min左右（見圖1A），可有效避免樣品基質干擾，實現準確定性和定量。此外，嘗試采用Waters Symmetry C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm，3.5 μm）在相同色譜－質譜條件下進行測試，色譜圖如圖1B所示。結果表明，Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱對21種麻醉劑的分離保留效果更好。因此，實驗采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色譜柱配合HPLC－MS/MS測定護膚品中21種麻醉劑的含量，在確保化合物響應的前提下，使目標組分的保留增強，實現了分離度與靈敏度的兼顧。

圖1 2種不同色譜柱對21種麻醉劑的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 21 anesthetics by 2 different chromatographic columns

2.1.2流動相的選擇采用選定的色譜柱，在混合模式分離機制下以緩沖鹽和有機相為流動相體系。考慮到該色譜柱適用的緩沖鹽濃度范圍，以及盡可能使用較低濃度的緩沖鹽添加劑以降低對質譜系統的污染，選擇緩沖鹽濃度為20 mmol·L?1。實驗首先考察了目標化合物在20 mmol·L?1甲酸銨溶液－乙腈和20 mmol·L?1乙酸銨溶液－乙腈兩種流動相體系下的質譜響應。結果表明，在20 mmol·L?1甲酸銨溶液－乙腈流動相體系下，大多數麻醉劑的質譜響應更高。質譜正模式下，為增強目標化合物的響應值，在20 mmol·L?1甲酸銨溶液中添加甲酸。進一步考察了相同洗脫梯度下，20 mmol·L?1甲酸銨溶液的pH值分別為4.0、5.0和6.0時，各目標化合物的質譜響應和同分異構體的分離情況。實驗表明，上述3種pH值條件下苯佐卡因和三卡因、丙美卡因和丙氧卡因這2對同分異構體均獲得良好的分離，當20 mmol·L?1甲酸銨溶液的pH值為4.0時，大多數麻醉劑的質譜響應更高，因此采用流動相的pH值為4.0。實驗同時發現，當有機相不加甲酸時，普魯卡因胺的峰形拖尾，在有機相乙腈中加入體積分數為0.035%的甲酸時，普魯卡因胺的峰形顯著改善。因此，最終采用20 mmol·L?1甲酸銨溶液（用甲酸調至pH 4.0）－乙腈（含0.035%甲酸）作為流動相，并進一步優化梯度洗脫程序。21種麻醉劑（100 ng·mL?1）的MRM色譜圖見圖1A。

2.2 質譜條件的優化

21種麻醉劑的化學性質使之在正離子掃描模式下更易離子化。在ESI+模式下，分別對質量濃度為50 ng·mL?1的21種麻醉劑標準溶液進行母離子掃描，均可獲得響應最好的準分子離子峰，且均為［M +H］+峰。對母離子進行子離子掃描，選擇響應較強、干擾較小的2個子離子作為定性離子，其中響應最大的子離子作為定量離子，最后分別對每種麻醉劑的去簇電壓和碰撞能量進行優化。優化后的質譜條件見表1。

2.3 提取條件的優化

QuEChERS法的常用提取溶劑為乙腈，實驗采用乙腈作為提取溶劑進行考察。若在樣品中直接加入乙腈，膏霜類等樣品的復雜基質不易分散，所以先加入水使樣品充分分散混勻后再加入乙腈進行提取。在空白樣品中加入21種麻醉劑的混合標準溶液，按照“1.2.1”步驟，考察了乙腈、乙腈（含0.1%甲酸）、乙腈（含0.5%甲酸）和乙腈（含1.0%甲酸）作為提取溶劑時21種麻醉劑的提取回收率，結果見圖2。由圖2可知，大約50%組分的提取回收率受甲酸體積分數的影響不大，但有50%的麻醉劑在乙腈（含1.0%甲酸）作為提取溶劑時的提取回收率明顯高于其他3種提取溶劑，故實驗選取乙腈（含1.0%甲酸）作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對樣品中21種麻醉劑提取回收率的影響Fig.2 Effect of variety of extraction solvent on the recoveries of 21 anesthetics in samples

2.4 凈化條件的選擇

護膚品基質主要有脂類（角鯊烷、合成甘油三酯等）、蠟類（蜂蠟、石蠟等）和有機酸等。QuEChERS方法常用的吸附劑中，C18可吸附脂類、蠟類等非極性雜質，PSA可吸附有機酸、色素及金屬離子等，無水硫酸鎂可吸收有機相中殘留的水分，所以實驗選取含C18、PSA以及無水硫酸鎂的QuEChERS凈化試劑包作為凈化吸附劑。

2.5 基質效應評價

護膚品的基質較為復雜，因此對21種麻醉劑的基質效應進行了考察。基質效應（Matrix effect，ME）按照公式ME=（基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率）× 100%計算。ME越接近100%，表明基質效應越小。ME在80% ~ 120%范圍內，表明存在基質效應，但影響較低，可忽略不計；超出此范圍則表明基質效應較明顯。選擇膏霜、乳液和凝膠3種具有代表性的復雜基質，通過實驗分別獲得21種麻醉劑的基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線，計算ME值。由表2可知，21種麻醉劑在3種基質中存在不同程度的基質效應，且以基質抑制為主。因此，通過基質匹配標準曲線進行定量，以更準確地反映護膚品中21種麻醉劑的含量。

表2 21種麻醉劑在不同基質中的回收率、相對標準偏差（n = 6）和基質效應Table 2 Recoveries，relative standard deviations（n = 6） and matrix effects of 21 anesthetics in different matrices

（續表2）

2.6 線性方程、檢出限與定量下限

在“1.3”條件下，對21種麻醉劑的系列基質混合標準工作溶液進行測定，以化合物定量離子的色譜峰面積為縱坐標（y），以各組分的質量濃度為橫坐標（x，ng·mL?1）繪制標準曲線，計算線性方程和相關系數。以空白樣品的3倍信噪比確定檢出限（LOD，S/N= 3），10倍信噪比確定定量下限（LOQ，S/N= 10）。由表3可知，21種麻醉劑在0.5 ~ 100 ng·mL?1質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r）均大于0.99，方法檢出限為0.1 ~ 3 μg·kg?1，定量下限為0.3 ~ 10 μg·kg?1。

表3 21種麻醉劑的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of 21 anesthetics

2.7 加標回收實驗

分別選取具有代表性的膏霜、乳液和凝膠3種護膚品進行加標回收實驗。稱取經檢測不含21種麻醉劑的樣品，分別添加低、中、高3個水平的混合標準溶液于樣品中，分別做6次平行實驗。由表2可知，在3個加標水平下，21種麻醉劑的平均回收率為84.3% ~ 109%，相對標準偏差（RSD）為0.70% ~7.1%，表明本方法的準確度和精密度良好。

2.8 實際樣品分析

應用本方法對市面45批次護膚品進行測定，其中1批次樣品檢出利多卡因（含量為107 mg·kg?1），1批次樣品檢出丙胺卡因（含量為83.8 mg·kg?1），均為宣稱具有舒緩功效的眼部護膚品。典型陽性樣品（檢出利多卡因）的色譜圖見圖3。其余樣品均未檢出本方法涉及的21種麻醉劑。

圖3 陽性樣品的MRM總離子流圖（A）和利多卡因的提取離子流圖（B、C）Fig.3 MRM total ion chromatogram（A） and extracted ion chromatograms of lidocaine（B，C） in a positive sample

3 結 論

本文建立了QuEChERS/高效液相色譜－串聯質譜同時快速測定護膚品中21種麻醉劑的分析方法。該方法前處理簡單，創新性地采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色譜柱對護膚品中的21種麻醉劑進行含量測定，實現了分離度與靈敏度的兼顧，可在15 min內對21種麻醉劑進行快速篩查，檢出限低，定性定量準確，可為護膚品的安全監管提供有力的技術支持。