基于Fe3O4@SiO2@NH2@C60的磁固相萃取/氣相色譜－質譜聯用檢測中藥材中多環芳烴

宋中榮，周 翔*，蔣青香，嚴志宏，蔡 瑛，李 慧*

（1.江西中醫藥大學 藥學院，江西 南昌 330004；2.中國中醫科學院中醫藥健康產業研究所，江西 南昌 330029）

中藥作為我國醫藥的重要組成部分，在疾病的預防、診斷、治療等方面發揮著重要作用。中藥材是中藥及相關產品的源頭，其有效性和安全性將直接影響中藥產品的質量。中藥外源污染物是影響中藥材質量的關鍵因素之一，已成為中藥走向國際貿易的重要技術壁壘［1］。

多環芳烴（PAHs）是中藥材的主要外源污染物之一，具有致癌、致畸、致突變效應［2］，可造成神經系統損傷、呼吸系統破壞等危害［3－5］，受到世界各國的廣泛關注。美國國家環境保護局將萘、菲、芘、苯并［g，h，i］芘等16種PAHs列為優先控制污染物，我國也將萘、熒蒽、苯并［g，h，i］芘等7種PAHs列入環境污染黑名單［6］。PAHs是一種持久性有機污染物，易遠距離遷移，廣泛存在于空氣、土壤和水中，并可能通過各種途徑進入中藥飲片［6－7］。如植物類中藥材在生長過程中可能吸收來自自然環境中的PAHs；此外，飲片的高溫炒制、蒸制、熏制等炮制過程中也可能產生PAHs［6］。根據文獻報道，葛根、桔梗、番瀉葉、連翹、杜仲、柴胡、決明子等中藥材中均存在一定量的PAHs污染物［8－12］。

目前，檢測PAHs常用的樣品前處理方法主要有固相萃取［9，12－14］、固相微萃取［8］、QuEChERS［15］、濁點萃取［16］和凝膠滲透色譜［10，17］等。但上述方法存在繁瑣、耗時、有機溶劑用量大等不足，而PAHs在中藥材中僅痕量存在，且復雜的中藥材樣品基質容易對檢測結果造成干擾，凈化效果不佳時會嚴重影響目標物的測定準確度和重復性。因此，需要建立一種簡單、選擇性強、檢出限低的前處理方法來富集中藥材樣品中的PAHs。

磁固相萃取（MSPE）是一種以磁納米粒子（MNPs）作吸附劑，通過外加磁場使MNPs與基質分離的固相萃取技術，是一種新型的樣品前處理技術，已廣泛應用于分離富集復雜基質中的痕量目標物［18－20］。MNPs作為MSPE技術的核心，具有比表面積大、表面易功能化、易于操控和再生等優點，通過使用不同基團對其表面進行修飾，可使MNPs與目標物通過氫鍵、π－π鍵等作用力進行連接，從而選擇性吸附目標物。C60又稱為足球烯、富勒烯，作為碳的同素異形體，具有足球狀結構，其特殊結構可使大量的共軛π電子云分布在其內外表面上［21－22］，使得C60可與芳香族類化合物以及含有不飽和鍵類化合物通過π－π鍵結合，已廣泛應用于污染物的處理［23－26］。

本文以水合熱法合成的Fe3O4@SiO2@NH2@C60為吸附劑，建立了一種易操作、靈敏度高、準確性好、能有效降低中藥材樣品中復雜基質對PAHs目標物干擾的磁固相萃取/氣相色譜－質譜聯用（MSPE/GC－MS）檢測方法。以根、葉、果實入藥的7種典型中藥材（葛根、玄參、桑椹、梔子、桔梗、牡丹皮、淫羊藿）為研究對象，采用該方法探究了中藥材中PAHs的污染情況，以期為進一步完善中藥材的質量控制提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

玄參、梔子、桔梗、牡丹皮、淫羊藿（批號分別為2104002、2104002、2111001、2109001、2108001）購于安國市昌達中藥飲片有限公司；葛根、桑椹（批號分別為211108、20211207－1）購于南昌昌盛大藥房。

C60（99.9%）、三乙胺（99.0%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%）購于上海易恩化學技術有限公司（羅恩試劑）。正硅酸乙酯（TEOS，98%）購于上海麥克林生化科技股份有限公司。FeCl3·6H2O（99%）、FeSO4·7H2O（99%）、氨水（26.5%）、異丙醇（99.7%）、無水乙醇（99.7%）、二氯甲烷（99.5%）、色譜級甲醇（99.9%）、色譜級正己烷（95%）、無水硫酸鈉（99%）購于西隴科學股份有限公司。甲苯（99.5%）、水合肼（80%）、丙酮（99.5%）購于國藥集團化學試劑有限公司。

16種PAHs混合標準溶液（2 000 mg/L，≥ 96%，溶于苯－二氯甲烷（體積比1∶1））購于Sigma－Aldrich有限公司，包括萘（Nap）、苊烯（Aceny）、苊（Acen）、芴（Flu）、菲（Phen）、蒽（Ant）、熒蒽（Fluo）、芘（Pyr）、苯并［a］蒽（B［a］A）、?（Chr）、苯并［b］熒蒽（B［b］F）、苯并［k］熒蒽（B［k］F）、苯并［a］芘（B［a］P）、茚并［1，2，3-cd］芘（I［1，2，3-cd］P）、二苯并［a，h］蒽（DB［a，h］A）、苯并［g，h，i］芘（B［g，h，i］P）。5種PAHs同位素內標混合溶液（2 000 mg/L，≥ 98%，溶于二氯甲烷）購于上海安譜實驗室技術有限公司，包括萘－D8（Nap－D8）、苊烯－D10（Acen－D10）、菲－D10（Phen－D10）、?－D12（Chr－D12）和苝－D12（Per－D12）。

1.2 儀器與設備

8860型氣相色譜儀、5977B型質譜檢測器（美國Agilent科技有限公司）；IS5型傅里葉變換紅外光譜儀（FT－IR，美國Thermo Fisher Scientific有限公司）；SU8010型掃描電子顯微鏡（SEM，日本Hitachi有限公司）；7404型振動樣品磁強計（VSM，美國Lake Shore公司）；RCT－B－S025型磁力攪拌器（德國IKA儀器設備有限公司）；C－15R型高速離心機（德國納赫特有限公司）；KQ－500B型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex－M型渦旋儀（上海滬析實業有限公司）；DZF－6020型真空干燥箱（寧國沙鷹科學儀器有限公司）；MS105DU型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多中國科技有限公司）。

1.3 Fe3O4@SiO2@NH2@C60 MNPs的合成［27－28］

采用水熱法合成Fe3O4MNPs：取4.0 g FeCl3·6H2O，加入30 mL超純水溶解，再加入2 mL水合肼和10.9 g FeSO4·7H2O，800 r/min強烈攪拌下加入氨水至溶液pH值為9。室溫下400 r/min攪拌30 min，80 ℃下攪拌1 h，冷卻后使用磁鐵收集，水洗3次，60 ℃真空干燥12 h，得Fe3O4MNPs。

取1 g Fe3O4MNPs分散于100 mL異丙醇和8 mL超純水的混合物中，氮氣保護，超聲15 min，依次加入10 mL氨水和8 mL TEOS，45 ℃下400 r/min攪拌12 h。使用磁鐵收集，分別用水和乙醇洗滌3次，60 ℃真空干燥12 h，得Fe3O4@SiO2MNPs。

取1 g Fe3O4@SiO2MNPs分散于100 mL甲苯中，在N2氣氛下，超聲處理30 min。加入1 mL三乙胺和2 mL APTES后，將溶液加熱至110 ℃，以400 r/min繼續攪拌反應24 h，合成氨基改性產物。分別用水和乙醇洗滌3次，60 ℃下真空干燥，得Fe3O4@SiO2@NH2MNPs。

取2 g Fe3O4@SiO2@NH2MNPs溶于80 mL甲苯中，在N2氣氛下，超聲處理20 min。加入1 mL三乙胺，400 r/min攪拌30 min后，添加1 g C60。將混合物溶液加熱至110 ℃，于400 r/min下反應12 h。分別用水和乙醇洗滌3次，60 ℃下真空干燥，得Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs。

1.4 標準溶液的配制

使用正己烷將16種PAHs混合標準溶液和5種PAHs同位素內標混合溶液分別稀釋至質量濃度均為2 000 μg/L的PAHs標準儲備溶液和PAHs同位素內標儲備溶液，于?4 ℃下保存備用。

1.5 中藥材樣品處理

稱取2.0 g中藥材粉末（過4號篩），添加100 μL同位素內標物。加入20 mL二氯甲烷超聲20 min，重復2次，合并提取液，在4 ℃下以5 000 r/min離心5 min，收集濾液，氮吹濃縮至近干。向殘留物中添加10 mg Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs以及10 mL超純水，用渦旋儀將混合溶液渦旋4 min，以吸附PAHs。渦旋完成后使用強磁鐵收集MNPs，傾去上清液。添加2 mL正己烷，用渦旋儀將混合溶液渦旋2 min，使PAHs從Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs上洗脫下來，收集洗脫液并加入適量的無水硫酸鈉靜置片刻，吸取洗脫液中的水分。最后，將洗脫液用0.22 μm有機濾膜（尼龍）過濾后，轉移至樣品瓶中進行GC－MS分析。

1.6 色譜－質譜條件

色譜條件：HP－5 MS毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，美國Agilent科技有限公司）進行色譜分離。采用高純度氦氣（純度≥ 99.999%）作為載氣，流速為1 mL/min。進樣口溫度為280 ℃，采用不分流進樣模式，進樣體積為1 μL。升溫程序為：初始80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至180 ℃，以3 ℃/min升至200 ℃，然后以6 ℃/min升至250 ℃并保持3 min，最后以3 ℃/min升至300 ℃并保持6 min。

質譜條件：質譜儀電離模式為70 eV下的電子電離（EI）。四極桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，MS傳輸線溫度為280 ℃，溶劑延遲3.5 min。采用離子監測（SIM）模式對數據進行采集，16種PAHs的保留時間、特征碎片離子和定量內標物（ISTD）見表1。

表1 16種PAHs及定量內標物的保留時間、定量離子與定性離子Table 1 Retention times，quantitative ions，qualitative ions of 16 PAHs and quantitative internal standards

1.7 數據處理

Agilent MassHunter Workstation（10.2.733.8）用于數據采集。使用Excel 2019對16種PAHs進行統計分析，計算數據均值、誤差、回收率、相對標準偏差（RSD）；使用GraphPad Prism8.4.0制圖；使用SPSS 21.0進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 磁納米粒子表征

Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的FT－IR光譜如圖1所示。Fe3O4MNPs在500 ~ 600 cm?1處顯示出Fe—O的拉伸振動峰［29］；經SiO2改性后，在1 100 ~ 1 200 cm?1處出現1個新的強大的寬峰，此峰屬于Si—O—Si拉伸振動峰［30］；Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs在524、578、1 180、1 427 cm?1處顯示4個弱峰，與C60所顯示的吸收峰一一對應，表明C60已被修飾到Fe3O4MNPs表面。

圖1 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的FT－IR光譜Fig.1 FT－IR spectra of Fe3O4，Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@NH2 and Fe3O4@SiO2@NH2@C60

使用SEM對磁納米粒子的形貌進行研究。圖2A ~ 2D表明，Fe3O4MNPs隨著進一步的硅烷化、氨基化以及C60的功能化，所有MNPs尺寸在50 ~ 1 000 nm范圍內逐步增大。圖2D能夠明顯看出被C60功能化的MNPs形成了許多樹枝狀突起，這些突起能使其與目標物更充分接觸，從而有效吸附PAHs。

圖2 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）、Fe3O4@SiO2@NH2（C）與Fe3O4@SiO2@NH2@C60（D）的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of Fe3O4（A），Fe3O4@SiO2（B），Fe3O4@SiO2@NH2（C） and Fe3O4@SiO2@NH2@C60（D）

通過VSM測定了磁納米粒子的磁力曲線，結果如圖3所示。所有MNPs的磁滯回線未出現磁滯現象，表明制備的MNPs具有超順磁性。Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的 飽 和 磁 化 值 分 別 為71.3、42.2、32.9、26.6 emu/g，Zhang等［31］證明MNPs的飽和磁化值為16.3 emu/g時在外加磁鐵的作用下足以實現固液分離。本文所制備的MNPs雖經進一步的修飾后，磁化強度有所降低，但依然能夠快速實現固液分離，使得Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs能夠在強磁體的作用下易于從溶液中分離。

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的磁滯回線Fig.3 Hysteresis loops of Fe3O4，Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@NH2 and Fe3O4@SiO2@NH2@C60

2.2 磁固相萃取條件的優化

中藥材中PAHs的提取方法對測定結果至關重要，本文參考安徽省地方標準DB 34/T 3304－2018［32］選擇超聲提取法。該方法高效、省時、易操作，是美國國家環境保護局（USEPA）推薦的PAHs提取方法。為提高整個前處理過程中PAHs的回收率，以葛根（加入500 μg/kg PAHs標準溶液）作為樣品，分別對萃取溶劑類型、吸附劑用量、吸附時間、解吸溶劑類型和解吸時間進行了優化，每個實驗重復3次。

萃取溶劑種類優化：分別考察了甲醇（MeOH）、正己烷、二氯甲烷（DCM）、丙酮作為萃取溶劑時的效果。由圖4A可知，以二氯甲烷作為萃取溶劑時，PAHs的回收率最高，其原因可能是二氯甲烷的沸點最低，PAHs的沸點相對較高，萃取吹干過程中沸點低的物質能很好保護沸點高的物質［28］；并且二氯甲烷的弱極性可使PAHs有更好的溶解度，在雙重作用下能夠使PAHs在萃取吹干的過程中損失率降到最低。因此選用二氯甲烷作為萃取溶劑。

吸附劑用量優化：分別考察了Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs用量為5、10、15、20 mg時對PAHs回收率的影響。由圖4B可知，吸附劑用量由5 mg增至10 mg時，16種PAHs的回收率提升明顯；從10 mg上升至20 mg的過程中回收率無明顯變化。10 mg吸附劑已能夠完全吸附整個體系中的PAHs，更少的吸附劑可以降低實驗成本，因此選擇最佳的吸附劑用量為10 mg。

吸附時間優化：分別考察了2、4、6、8 min下的吸附效果（圖4C）。結果表明，吸附時間從2 min增至4 min時PAHs的回收率也隨之增加，從4 min增至8 min時PAHs的回收率保持不變，表明4 min足以使Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附體系中的PAHs。因此，選擇吸附時間為4 min。

圖4 萃取溶劑種類（A）、吸附劑用量（B）、吸附時間（C）對多環芳烴回收率的影響Fig.4 Effects of extraction solvent type（A），sorbent amount（B） and adsorption time（C） on the recoveries of PAHs

解吸溶劑種類優化：分別考察了甲醇、正己烷、二氯甲烷和丙酮作為解吸溶劑的效果，發現上述溶劑均可解吸PAHs，但正己烷對所有目標物的解吸效率最高。可能是因為正己烷的極性最低，遵循“相似相溶”原理，使PAHs的溶解度最大。因此，選擇正己烷為解吸溶劑。

解吸時間優化：以正己烷為解吸溶劑，分別考察了Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs在1、2、3、4 min下對PAHs的解吸情況。結果顯示，解吸時間由1 min升至2 min時PAHs的回收率提升明顯，且在2 min時回收率達到最高。因此，選擇解吸時間為2 min。

2.3 磁納米粒子的吸附性能

通過吸附葛根（加標500 μg/kg）樣品中PAHs考察了MNPs各階段的吸附能力、穩定性和重復利用率。為證明C60基團在吸附PAHs中的重要作用，在最優條件下比較了各階段MNPs的吸附能力。結果如圖5A所示，Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs對PAHs的吸附能力顯著高于其他階段MNPs（p< 0.05）。Fe3O4MNPs經包硅后對PAHs的富集作用略有減弱，進一步包氨后，對PAHs的富集作用優于Fe3O4MNPs，經過C60修飾后對PAHs的富集作用明顯提升，Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs表現出最好的吸附性能。這可歸因于C60所具有的π－π共軛體系、多孔、不飽和結構以及較大的比表面積［33］，能增強其與PAHs的相互作用，從而增強了對PAHs的選擇性吸附能力。

在最優的條件下，考察了3個不同批次Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附效率的再現性，以評估C60功能化磁納米粒子的穩定性。如圖5B所示，3批C60功能化磁納米粒子吸附16種PAHs的峰面積大小無顯著差異（p> 0.05），表明具有良好的再現性。

圖5 各階段MNPs（A）以及3批次Fe3O4@SiO2@NH2@C60 MNPs（B）對多環芳烴峰面積的影響Fig.5 Effects of MNPs at each stage（A） and Fe3O4@SiO2@NH2@C60 MNPs of three batches（B） on the peak areas of PAHs different letters（a，b，c，d） above the columns for the same substance represent significant differences in PAHs peak area（p < 0.05）

采用Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs的吸附性能評估其重復利用率。在最佳條件下使用Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附PAHs，完成每次吸附?解吸循環后，將Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs用解吸液再解吸2次，使PAHs完全洗脫下來，防止對下次吸附造成干擾，隨后進行下一次吸附。結果表明，在10次吸附－解吸循環過程中，Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附16種PAHs的峰面積大小趨于相對穩定，表明其性能可靠且穩定耐用。而Yang等［34］制備的Fe3O4@SiO2@MMTA－Au MNPs重復使用過程中回收率隨著使用次數的增加而降低，造成此差異的主要原因是C60結構中含有豐富的π－π鍵，能使其在吸附－解吸PAHs的過程中有更高的效率。因此，本文制備的Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs穩定性更好，可重復使用，能夠大幅降低實驗成本。

2.4 方法學考察

在最優的前處理條件下，采用GC－MS考察了16種PAHs的線性關系、檢出限（LOD）、定量下限（LOQ）等指標，各物質的總離子流色譜圖見圖6。由表2可知，16種PAHs的線性范圍為5 ~1 000 μg/L，相關系數（r2）為0.994 0 ~ 0.999 9，檢出限（S/N= 3）為0.2 ~ 1.2 μg/kg，定量下限（S/N=10）為0.8 ~ 3.9 μg/kg。在葛根樣品中加入16種PAHs混合標準溶液（500 μg/kg），通過計算6次重復測定的RSD評估日內和日間精密度（6 d），16種PAHs的日內RSD為0.20% ~ 3.5%，日間RSD為2.2% ~ 6.9%，說明本方法具有良好的重復性。為評估方法的準確性（以回收率表示），在葛根樣品中加入100、250、500 μg/kg水平的16種PAHs混合標準溶液，得到平均回收率為84.1% ~ 104%，RSD為0.70% ~ 8.3%（見表3）。結果表明，所建立的MSPE/GC－MS方法可以分析中藥材中的痕量PAHs。

圖6 PAHs混合標準溶液（250 ng/mL）和定量內標物（100 ng/mL）的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatogram of PAHs mixed standard solution（250 ng/mL） and quantitative internal standards（100 ng/mL）

表2 16種PAHs的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量下限及精密度Table 2 Linear equations，r2，linear ranges，LODs，LOQs and precisions of 16 PAHs

表3 加標葛根樣品中16種PAHs的平均回收率及相對標準偏差Table 3 Average recoveries and RSDs of 16 PAHs in spiked Pueraria lobata

（續表3）

本文對比了MSPE處理后以及未經處理的葛根樣品（加標250 μg/kg）的測定結果（圖7），表明經MSPE處理后能有效降低中藥材樣品中復雜基質對PAHs的干擾，可明顯提升目標物的測定準確度和重復性。Qin等［35］證明使用MSPE技術處理土壤樣品時，其凈化效果比硅膠柱法好，且與未凈化樣品相比，基質效應顯著降低。

圖7 經過處理與未經處理葛根樣品（加標250 μg/kg）的總離子流色譜圖Fig.7 Total ion flow chromatograms of treated and untreated Pueraria lobata samples（spiked at 250 μg/kg）

將所建立的方法與其他測定中藥材樣品中PAHs的方法進行了比較（表4）。相比其他方法，本方法能測定16種PAHs，回收率更高，且具有良好的精密度和線性范圍，是一種可快速測定PAHs的方法。

表4 該方法與其他測定多環芳烴方法的比較Table 4 Comparison of the developed method with other methods for the determination of PAHs

2.5 樣品測定

將所建立的方法用于檢測葛根、玄參、桑椹、梔子、桔梗、牡丹皮、淫羊藿7種中藥材中的16種PAHs含量，結果如表5所示。

由表5可知，7種中藥材中分別檢出8、13、4、9、7、11、11種PAHs，總量為166.9 ~ 1 292.4 μg/kg，桑椹中的PAHs總量最低，梔子中的PAHs總量最高，且梔子中菲的含量達473.4 μg/kg。Ishizaki等［8］在杜仲皮中檢出12種PAHs，總量達502.2 μg/kg；Yu等［10］在甘草根和玫瑰花中分別檢出14、10種PAHs，總量分別達1 966.0、806.0 μg/kg。歐盟委員會2015年規定干草藥中苯并［a］芘的最大含量為10.0 μg/kg，且苯并［a］芘、苯并［a］蒽、苯并［b］熒蒽和?4種PAHs的總量最大使用限量為50.0 μg/kg［36］，本文所測定的7種中藥材中有4種超過限量標準，可見中藥材中PAHs的污染情況比較嚴重，潛在的健康風險需進一步調查。

表5 7種中藥材中16種PAHs的含量（μg/kg，n = 3）Table 5 Contents of 16 PAHs in seven Chinese herbal medicines（μg/kg，n = 3）

3 結 論

本文合成了Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs，以其為吸附劑建立了MSPE/GC－MS同時測定中藥材中16種PAHs含量的方法。對Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs進行了表征以及吸附性能的考察，結果表明MNPs改性成功且具有超順磁性，吸附能力強，穩定性好，重復利用率高。優化了萃取溶劑種類、吸附時間、解吸時間等前處理條件，并在葛根樣品中添加不同濃度水平PAHs進行方法學驗證，結果表明方法的回收率及相對標準偏差符合要求。本方法操作性強、快速簡便、準確度高和精密度好，可以有效降低中藥材樣品中復雜基質對PAHs目標物的干擾，能夠滿足中藥材樣品中16種PAHs的測定要求。