血清4型禽腺病毒的分離鑒定及動物回歸試驗

李琳，楊金生，趙寒冬，袁陸，管郡，王楠，劉云志*

（1.吉林省畜牧獸醫科學研究院，吉林 長春 130062；2.長春農業博覽園，吉林 長春 130117 ；3.大安市畜牧總站，吉林 大安 131300）

血清4型禽腺病毒感染即肝炎-心包積液綜合征，又叫心包積液綜合征，是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FADV-4）引起的一種急性傳染病[1]。本病典型的發生過程是雞在3周齡出現死亡，在4～5周齡出現死亡高峰，然后死亡率開始下降。本病潛伏期短，發病快，呈急性死亡，死亡率在20%～80%。本病于1987年在巴基斯坦安卡拉地區首次暴發，因此也被稱為安卡拉病[2]。隨后在世界多個國家和地區均有報道，我國于2006～2014年有零星出現，2015年后在全國多個省份快速流行，給養禽業造成了巨大的經濟損失[3]。禽腺病毒屬共3個群，14個血清型，其中禽腺病毒血清4型屬Ⅰ群可引起雞的安卡拉病。由于Ⅰ亞群腺病毒作為原發病原的作用尚未搞清楚，不同的血清型，甚至相同血清型的不同毒株，其致病力和感染力差異很大，在造成發病和死亡或者引發呼吸道疾病的能力也有所不同。但當它與傳染性法氏囊病毒共同感染卻可增強禽腺病毒的致病性，共同感染雞貧血病病毒時能大大增強禽腺病毒引起肝炎和致死能力。本實驗室此次分離獲得的致病血清4型禽腺病毒毒株，初步命名為FADV-4 CC株，為下一步病毒的遺傳演化規律研究和發病分子機制研究打下基礎，并對該病在吉林省的流行防控、抗病毒藥物的篩選、疫苗研制都將具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2022年6 月吉林省長春市某蛋雞養殖場送檢49日齡病死雞（品種為海蘭褐），截止送雞前，死亡率達到20%以上，發病率在80%左右。病雞臨床主要表現為精神沉郁、羽毛成束，有明顯的呼吸道和神經癥狀。

1.2 主要試劑

瓊脂糖（分析純），50×TAE緩沖液，PBS，DL2000 DNA Marker，10×Loading Buあer，雙蒸餾水，PCR 用 ExTaq，10×ExTaq Buあer，dNTP Mixture，傳染性法氏囊病抗原快速檢測試紙（河南百奧生物工程有限公司）等。

1.3 引物設計與合成

引物設計主要參照安徽省地方標準《I群血清4型禽腺病毒核酸PCR檢測技術規程》（DB 34/T 3121—2018）[4]。上游引物 P1：FADV-4(5'-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC -3')，下游引物P2：FADV-4(5'- TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3')，擴增核酸片段大小為951 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。如果樣品的PCR產物電泳后在951 bp位置出現特異性的條帶，則判定為禽腺病毒4型核酸檢測陽性，反之為陰性。

1.4 病料處理與分離

無菌采取病雞心包積液、肝臟、脾臟、腎臟接種血瓊脂平板培養基，同時對病雞肝臟按1∶5 (V/V)比例加入生理鹽水研磨，反復凍融3次，經10 000r/min高速離心1 h，取上清液接種7日齡SPF雞胚（卵黃接毒），采集尿囊液，用尿囊液提取的核酸作為 DNA 模板進行 PCR 擴增。

1.5 PCR擴增禽腺病毒鑒定的反應體系

10×ExTaq buffer(Mg2+plus) 2.5 μL ，dNTP Mixture 1 μL，P1：FADV-4（10 μM）0.5 μL，P2：FADV-4（10 μM）0.5 μL，ExTaq 酶 0.3 μL，DNA 模板（質量濃度大于 129.6 pg/μL）2 μL，滅菌雙蒸水補至 20 μL，擴增參數為：第一階段94 ℃預變性5 min；第二階段94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個循環；第三階段 72 ℃延伸 10 min，PCR擴增產物通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結果。

1.6 血凝試驗（HA）、試紙條檢測

鑒于送檢病料需要實驗室病毒分離鑒定及后期雞群治療，檢測是否有混合感染發生，因此通過常規血凝試驗和傳染性法氏囊病抗原快速檢測試紙，檢測病雞是否患有新城疫、禽流感和傳染性法氏囊病這幾個主要易發疫病。

1.7 回歸試驗

試驗將15日齡的SPF雞分攻毒組和對照組，各5只。攻毒組中5只雞均肌肉注射尿囊液0.5 mL，其余5只雞肌肉注射生理鹽水0.5 mL。

2 結果與分析

2.1 剖檢及細菌學檢查結果

對送檢病死雞進行剖檢，可見心臟被淡黃色透明液體包裹，肝臟腫大、變黃（圖1）、有出血點（圖2），腎臟腫大，腸道無明顯病變。病料經血瓊脂平板培養基37 ℃培養24 h，無細菌生長。經詢問，雞場還未接種過腺病毒任何疫苗。

圖1 病死雞心包積液，肝臟腫大變黃

圖2 病死雞心包積液，肝臟有出血點

2.2 血凝試驗、試紙條檢測結果

采集尿囊液進行血凝試驗，不能凝集1%雞紅細胞懸液，證明分離毒株無血凝性，對照組新城疫病毒凝集1%雞紅細胞懸液；傳染性法氏囊病抗原快速檢測試紙檢測呈陰性，因此分離毒不含傳染性法氏囊病毒。

2.3 病毒分離和增殖

接種7日齡SPF雞胚5枚，置37 ℃繼續孵化，雞胚分別于接種后3日死亡3枚，4日1枚，5日死亡1枚，無菌采集死亡雞胚的尿囊液。

2.4 PCR 擴增結果

以尿囊液提取的核酸作為DNA模板，通過PCR檢測，在951 bp處出現目的條帶，陰性對照未見特異條帶（圖3）。

圖3 血清4型禽腺病毒的PCR鑒定

2.5 回歸試驗

用無菌采集的尿囊液既命名為FADV-4 CC株攻毒15日齡的SPF雞，發病率和死亡率均為100%（5/5），剖檢死亡攻毒雞發現肝臟腫大變黃明顯，心臟被一層薄膜包裹，可見明顯心包積液（圖4和圖5）。對照組雞只無臨床癥狀，均健康存活。

圖4 攻毒SPF雞肝臟變黃、有出血點，可見心包積液

圖5 攻毒SPF雞肝臟明顯變黃

3 小結

禽腺病毒屬于腺病毒科禽腺病毒屬成員為雙股DNA病毒。血清4型禽腺病毒屬于禽腺病毒C種成員FAV-4型，被認為是引起雞心包積液綜合征的病原[5]。本病可垂直傳播也可水平傳播，以心臟被淡黃色透明液體包裹、肝臟腫大為特征。養殖戶一般均在70日齡首免，30日后進行第二次免疫，一些養殖戶開產前還進行一次加強免疫。由于個別養殖場周邊沒有發生過腺病毒，養殖戶抱有僥幸心理不接種腺病毒疫苗，近年來導致該病毒在某些地區仍有零星發生。該病暴發突然，發病率高，治療后蛋雞產蛋量只能達到80%～85%左右，且后期一些處于亞健康雞只由于免疫力低仍會有零星死亡，給養殖場造成了一定的經濟損失。因此，在加強飼養管理的同時，建議通過新流腺三聯滅活疫苗【雞新城疫、禽流感（H9亞型）、禽腺病毒病（I群4型）三聯滅活疫苗（La Sota株+YT株+QD株）】或新流法腺四聯滅活疫苗來對本病進行有效預防和控制。對未接種疫苗雞場，建議及時補免。若發生疫情應先緩解臨床癥狀，采用中藥抗病毒藥同時用抗生素，以此提高機體的免疫力，補免完成的同時要密切關注群體，防止應激的發生。