TAE緩沖液應(yīng)用于對(duì)流免疫電泳的實(shí)驗(yàn)效果分析

張淑莉 方佳妮 康寶麗 王丹煬 劉欣雨 高瑞鵬

1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)中心 陜西西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1936班 陜西西安 710021

對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrphoresis，CIEP)是可溶性抗原和抗體在雙向免疫擴(kuò)散的基礎(chǔ)上與電泳相結(jié)合的定向加速免疫擴(kuò)散技術(shù)。由于電泳技術(shù)的采用，使在緩沖液體系中帶電的抗原抗體呈定向運(yùn)動(dòng)，加快了兩者的結(jié)合，并且限制了抗原抗體在介質(zhì)中向四周擴(kuò)散的傾向，提高了反應(yīng)時(shí)間，顯著增加了實(shí)驗(yàn)靈敏度[1]，常用于抗原或抗體的定性分析、效價(jià)測(cè)定及純度鑒定[2]。對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)在臨床檢驗(yàn)和醫(yī)學(xué)院校的臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)中有很重要意義。對(duì)流免疫電泳的原理是在pH值為8.6的瓊脂凝膠中，大部分蛋白質(zhì)抗原等電點(diǎn)低，帶較強(qiáng)負(fù)電荷，且分子量小，電泳力大于電滲力，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；而抗體絕大多數(shù)為IgG，因其等電點(diǎn)偏高，在pH值為8.6時(shí)帶微弱的負(fù)電荷，且分子量較大，移動(dòng)速度慢。因此在電場(chǎng)中電泳力小于電滲力，在電場(chǎng)中移向負(fù)極，電泳時(shí)，將抗原孔放負(fù)極端，抗體孔放正極端，則抗原抗體相向運(yùn)動(dòng)，在兩孔之間相遇，并在比例適當(dāng)?shù)牟课恍纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線。目前，對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用的緩沖液是巴比妥-巴比妥鈉緩沖液[3]。但由于巴比妥-巴比妥鈉是一類抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥品，它具有鎮(zhèn)定、催眠、麻醉等作用，近年來(lái)為國(guó)家管制類藥品，存在一定安全隱患且價(jià)格較高，購(gòu)買困難，影響了對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)教學(xué)的開(kāi)展。因此需要找到一種試劑安全性高、實(shí)驗(yàn)效果好、試劑成本低又環(huán)保的實(shí)驗(yàn)材料，來(lái)替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖溶液，在測(cè)試多種常見(jiàn)pH值為8.2～8.6的緩沖液后，筆者采用TAE緩沖液應(yīng)用于對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)并取得較好效果，并且可以作為醫(yī)學(xué)院校對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的新型緩沖液。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

抗原：正常人新鮮血清；抗體：購(gòu)買商品(使用前用生理鹽水分別做抗體原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀釋度)，載玻片，打孔器，移液器及移液器吸頭，打孔樣紙，5ml刻度吸管，洗耳球，牙簽，記號(hào)筆，濕盒。

1.2 主要器材

電子分析天平，北京六一儀器廠直流穩(wěn)壓電泳儀(DYY-6C)及配套水平電泳槽，湘儀離心機(jī)。

1.3 試劑

巴比妥-巴比妥鈉電泳緩沖液(pH值為8.6，離子強(qiáng)度0.05)：先稱取巴比妥1.84克置于三角燒瓶中，加入200ml蒸餾水，加熱溶解后加入巴比妥鈉10.3克，最后加蒸餾水至1000毫升(調(diào)pH值至8.6)；TAE緩沖液：稱取Tris4.84g，Na2EDTA·2H2O0.744g，冰乙酸1.142mL，加蒸餾水至1000ml；瓊脂粉凝膠：稱取瓊脂粉分別加入TAE緩沖液和pH值為8.6的巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，使瓊脂濃度為10g/L，沸水浴中溶解至透亮澄清，放60～70℃水浴箱中保溫備用。

2 方法

(1)制板與打孔：取干凈載玻片，將1%融化瓊脂凝膠4.5ml澆于載玻片上，厚度約1.5～2.0mm。待瓊脂凝固后，按打樣模板去打孔，標(biāo)記抗原抗體方向。

(2)加樣：在加樣孔中加入抗原10μL和抗體10μL。

(3)電泳：將已經(jīng)加好樣的瓊脂板平放于電泳槽中，瓊脂板兩端用紗布搭橋與電泳槽中緩沖液相連接，抗原孔接電源負(fù)極，抗體孔接正極，開(kāi)啟電源，調(diào)整電壓和電流強(qiáng)度，通電50～60min。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

電泳結(jié)束后關(guān)閉電源，在光線充足的情況下，將玻片對(duì)著光，觀察載玻片上抗原抗體孔之間是否有白色清晰沉淀線出現(xiàn)，如果有沉淀線形成判定為陽(yáng)性，無(wú)沉淀線出現(xiàn)為陰性。如果沉淀線不夠清楚，將濕盒放置37°C保溫箱中數(shù)小時(shí)，可增強(qiáng)沉淀線的清晰度。

(1)以巴比妥-巴比妥鈉緩沖液為介質(zhì)對(duì)流免疫電泳電泳圖譜見(jiàn)圖1(自左上順時(shí)針旋轉(zhuǎn)分別為抗體原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀釋度)。

圖1 以巴比妥-巴比妥鈉緩沖液為介質(zhì)電泳圖譜

(2)以TAE緩沖溶液為介質(zhì)對(duì)流免疫電泳電泳圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 以TAE緩沖溶液為介質(zhì)對(duì)流免疫電泳圖譜

圖1、圖2分別是以巴比妥-巴比妥鈉緩沖液、TAE緩沖液為介質(zhì)，人血清作為抗原進(jìn)行的對(duì)流免疫電泳，電泳圖譜如圖1、圖2所示：在抗體原倍、1∶2、1∶4、1∶8稀釋度條件下均可見(jiàn)清晰白色沉淀線即為抗原抗體復(fù)合物。重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)后，比較這兩種緩沖液的電泳結(jié)果基本相當(dāng)，但TAE緩沖溶液電泳結(jié)果在1∶8稀釋度下比巴比妥-巴比妥鈉緩沖液1∶8稀釋度下的沉淀線更為明顯，反應(yīng)結(jié)果更好。

4 結(jié)論

“臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)”主要通過(guò)研究免疫學(xué)理論和免疫學(xué)技術(shù)并將其應(yīng)用于臨床樣本的定性、定量檢測(cè)，輔助臨床對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行診斷的一門(mén)重要醫(yī)學(xué)學(xué)科，該課程不僅理論性強(qiáng)、技術(shù)應(yīng)用廣、實(shí)用性強(qiáng)，還與臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)、臨床血液學(xué)檢驗(yàn)、臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)、臨床寄生蟲(chóng)學(xué)檢驗(yàn)等多學(xué)科既廣泛聯(lián)系，又相互交叉，是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)本科生必修的一門(mén)重要的主干課程，臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)不僅是臨床醫(yī)生對(duì)免疫相關(guān)性疾病進(jìn)行分析和診斷的依據(jù)，還對(duì)免疫相關(guān)疾病的治療效果和病情判斷上有很重要的價(jià)值，對(duì)臨床檢測(cè)工作起重要指導(dǎo)作用[4]。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)畢業(yè)生大多數(shù)從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)相關(guān)的工作崗位，實(shí)驗(yàn)操作技能是畢業(yè)生立足社會(huì)的基本能力。所以實(shí)驗(yàn)教學(xué)是臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)教學(xué)的重要組成部分，其在培養(yǎng)學(xué)生扎實(shí)的理論基礎(chǔ)和專業(yè)技能，建立系統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)思維方面具有重要作用[5]。通過(guò)開(kāi)展臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，使學(xué)生掌握了各項(xiàng)免疫學(xué)技術(shù)的檢測(cè)原理、操作方法、注意事項(xiàng)、臨床應(yīng)用等，了解臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的各種新技術(shù)新方法，拓寬學(xué)生臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)方面的知識(shí)視野，不但培養(yǎng)學(xué)生熟練的動(dòng)手操作能力、綜合分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力以及科研創(chuàng)新能力，還有助于調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣[6-7]，提升學(xué)生認(rèn)識(shí)并解決在以后學(xué)習(xí)和工作中遇到的各種實(shí)際問(wèn)題，以培養(yǎng)適應(yīng)21世紀(jì)醫(yī)療衛(wèi)生發(fā)展需要的高質(zhì)量、應(yīng)用型醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)技術(shù)人才。

目前關(guān)于對(duì)流免疫電泳緩沖溶液優(yōu)化的研究并不多見(jiàn)，現(xiàn)就近年來(lái)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。早期楊瑞景[8]根據(jù)電解質(zhì)的導(dǎo)電性能，嘗試使用0.15%的氯化鈉溶液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液對(duì)乙型肝炎抗原和胎甲蛋白進(jìn)行檢測(cè)，該替代緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便。其中，氯化鈉溶液比巴比妥-巴比妥鈉緩沖液價(jià)格便宜375倍，并且在臨床試驗(yàn)中取得了較好的結(jié)果。但在電泳過(guò)程中，NaCl緩沖液會(huì)被電解產(chǎn)生氯氣，對(duì)實(shí)驗(yàn)者存在一定危害性，因此氯化鈉溶液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液的方法并未得到廣泛普及。張立紅[9]在技術(shù)上進(jìn)行了改進(jìn)后，選用電泳槽緩沖液pH值為8.6，離子強(qiáng)度由0.1巴比妥鹽酸緩沖液或pH值為8.6，離子強(qiáng)度0.06巴比妥緩沖液，該方法不需要昂貴的儀器設(shè)備和專供試劑盒，一般實(shí)驗(yàn)室就能開(kāi)展抗原或抗體檢測(cè)，此方法簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)，節(jié)省了試劑，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。近年來(lái)周瑞雪[10]等人從常用緩沖液中篩選出6種pH值在8.6的緩沖液進(jìn)行電泳后研究表明，Tris-HCl、巴比妥-巴比妥鈉、TAE、Gly-NaOH和NaCl-NaOH緩沖液均可作為對(duì)流免疫電泳的緩沖液。但從電泳后抗原抗體形成白色沉淀線的結(jié)果來(lái)看，Tris-HCl緩沖液在對(duì)流免疫中效果最好，它作為緩沖液不僅能產(chǎn)生白色沉淀線，而且有很好的抗體濃度依賴趨勢(shì)。巴比妥-巴比妥鈉、TAE、Gly-NaOH、NaCl-NaOH電泳效果依次次之，TGS緩沖液電泳效果最差，沒(méi)有白色沉淀線出現(xiàn)，最終認(rèn)為在對(duì)流免疫電泳中，Tris-HCl緩沖液替代傳統(tǒng)巴比妥-巴比妥鈉緩沖液效果最好。因此認(rèn)為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課中可以將Tris-HCl作為對(duì)流免疫電泳的緩沖液。Tris-HCl緩沖溶液、NaCl-NaOH緩沖溶液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，雖然實(shí)驗(yàn)原料易獲取，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，實(shí)驗(yàn)效果良好，但對(duì)流免疫電泳目前主要應(yīng)用于教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，這兩種緩沖液在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能會(huì)電解生成有毒氣體氯氣，以及有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的使用，實(shí)驗(yàn)安全性不高，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能會(huì)危害到實(shí)驗(yàn)人員的健康。而TAE緩沖液(TAE Buffer)是由三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)按一定比例配制組成的緩沖液，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，TAE緩沖液的電泳效果較好，在保證對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的前提下，安全性較高，沒(méi)有強(qiáng)酸，強(qiáng)堿的使用，也沒(méi)有有毒氣體生成，并且實(shí)驗(yàn)成本較低，在對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)中有清晰免疫沉淀線，完全能夠替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液在對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)中的使用。本次成功使用TAE緩沖液替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，同時(shí)在操作中我們還注意了以下幾個(gè)方面：

(1)加樣時(shí)孔內(nèi)不要有氣泡，孔內(nèi)加入抗原或抗體時(shí)以加滿為宜，盡量不要外溢；血清標(biāo)本要盡量新鮮不能用溶血或陳舊標(biāo)本。

(2)電泳時(shí)電壓不要太大，免得蛋白質(zhì)變性，出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(3)抗原抗體的含量和比例要合適，否則不會(huì)出現(xiàn)明顯可見(jiàn)沉淀線。

(4)電泳所需要的時(shí)間與孔間距有關(guān)，孔間距越大，電泳時(shí)間越長(zhǎng)。

(5)電場(chǎng)強(qiáng)度、電泳緩沖溶液的pH值、溶液離子強(qiáng)度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果均有影響，電泳速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶點(diǎn)顆粒移動(dòng)速度越快；溶液的pH值高于顆粒的等電點(diǎn)時(shí)顆粒帶負(fù)電荷，溶液pH值離某物質(zhì)的等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，該物質(zhì)所帶電荷量越多，分子量越小，泳動(dòng)越快；緩沖溶液的離子強(qiáng)度越高，電泳速度越慢。

在對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)中電泳介質(zhì)本實(shí)驗(yàn)室一直首選用瓊脂粉，在這次實(shí)驗(yàn)中也嘗試著將電泳介質(zhì)瓊脂粉換成瓊脂糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瓊脂粉的電泳效果均好于瓊脂糖，與周瑞雪等研究發(fā)現(xiàn)瓊脂糖實(shí)驗(yàn)效果好于瓊脂粉的研究結(jié)果不符，這還有待于進(jìn)一步的探索論證。

綜上所述，本文選用TAE緩沖液同傳統(tǒng)巴比妥-巴比妥鈉緩沖液的電泳結(jié)果都有明顯沉淀線，但TAE緩沖溶液電泳效果要好于巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，TAE緩沖液的試劑原料經(jīng)濟(jì)安全且容易獲取，并且使用瓊脂粉作為電泳介質(zhì)的結(jié)果優(yōu)于瓊脂糖，在對(duì)流免疫電泳實(shí)驗(yàn)教學(xué)中作為新型緩沖液完全能替代巴比妥-巴比妥鈉緩沖液，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，取得了良好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，值得推廣使用。