高效液相色譜法測定烏頭湯有效成分含量的方法建立

王佳，鄭淑晶，李陽，胡德，冷向陽，王淑敏

（長春中醫藥大學，吉林 長春 130117）

烏頭湯最早始載于張仲景的《金匱要略——中風歷節病脈證并治第五》中，“病歷節不可屈伸疼痛，烏頭湯主之”，臨床應用已有千年之久[1]。該方由川烏（制）、麻黃、白芍、黃芪和甘草（炙）組成，現代臨床應用主要用于治療膝骨關節炎、類風濕性關節炎、腰椎骨關節炎、腰椎間盤性疼痛及肩關節周圍炎效果顯著[2-4]，且副作用小。

有效成分是中藥材及中藥復方的物質基礎，是研究的重中之重[5]。利用現代科學技術對烏頭湯中各味藥材的化學成分及藥理作用進行研究發現，制川烏中主要活性成分為生物堿類，而單酯型生物堿如苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿為其主要活性物質，具有消炎鎮痛的功效[6]。麻黃堿和偽麻黃堿為麻黃的主要活性成分，已有研究表明其具有良好的抗炎、鎮痛及免疫調節等功效[7]，毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中黃酮類的主要成分，具有抗炎、抗病毒和免疫調節作用，可使氫化可的松致免疫功能低下模型鼠的細胞免疫功能恢復至正常水平。甘草中的甘草酸和甘草苷也具有相關藥理作用[8]。此外，毛霞等[9]通過分子對接技術、藥代動力學及SPR技術相結合，確立了芍藥苷為烏頭湯中有效成分之一。上述成分均為烏頭湯治療關節炎等相關疾病的有效成分，因此，本實驗針對烏頭湯中已有確切藥效的化合物為其有效成分，對其進行綜合評價，建立高效液相色譜分析方法，為烏頭湯的質量控制、多指標成分含量測定以及今后提取工藝和安全用藥提供研究方法和科學依據。

1 儀器與材料

1.1 試藥

芍藥苷（18032901）、甘草酸（18060805）、苯甲酰烏頭原堿（18110710）、苯甲酰次烏頭原堿（18032807）、苯甲酰新烏頭原堿（18032406）、新烏頭堿（17111010）、次烏頭堿（17111310）、烏頭堿（17110910）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（18031920）、甘草苷（18032801）購自于北京世紀奧科生物技術有限公司，鹽酸麻黃堿（171241-201809）、鹽酸偽麻黃堿（171237-201510）購自于中國食品藥品檢定研究院，乙腈、甲醇為色譜純（美國賽默飛世爾科技有限公司）、娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈有限公司），磷酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

島津LC-20AT系統（SPD-M20A PDA檢測器、SIL-20A自動進樣器，日本島津科技有限公司），電子天平（MS105DU，梅特勒-托利多儀器有限公司），超聲波清洗器（AS3120A，天津奧特賽恩斯儀器有限公司），冷凍干燥儀（Epsilon2-4Lsplus），高速離心機（TGL16M，湖南凱達科學儀器有限公司），pH計（PHSJ-3F，上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3 藥材

制川烏、黃芪、麻黃、白芍和炙甘草經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定分別為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx）的干燥母根，豆科黃芪屬植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]的干燥根，麻黃科植物草麻黃（Ephedra sinica Stapff）的干燥草質莖，毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall）的干燥根，豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）干燥根的蜜制品。以上藥材均購自吉林省宏檢大藥房。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Waters XSelect CSH C18（4.6 mm 250mm，5m），流動相：10 mmol/L磷酸二氫銨，磷酸調pH 2.1（A）-乙腈（B），采用梯度洗脫：0~8 min，95.5%A；8~11 min，95.5%~91%A；11~16 min，91%~82%A；16~30 min，82%~80% A；30~35 min，80%~77% A；35~43 min，77%~72% A；43~51 min，72%~57% A；51~59min，57%~5%A；59~65min，5%A，流速：1mL/min，柱溫：35℃，檢測波長：210 nm、235 nm，進樣量：5L。

2.2 對照品溶液配制

精密稱取適量鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿和甘草酸于容量瓶內，甲醇溶解定容至刻度，配制成濃度分別為0.46 mg/mL、0.32 mg/mL、0.53mg/mL、0.17 mg/mL、0.50 mg/mL、0.90 mg/mL、0.96 mg/mL、0.88 mg/mL、0.40 mg/mL、0.45 mg/mL、0.31mg/mL和0.60mg/mL的標準混合對照品溶液備用。

2.3 供試品溶液配制

稱取原處方4份（麻黃36 g、黃芪36 g、炙甘草36 g、白芍36 g、制川烏24 g）于煎藥壺內，加入12倍量水浸泡30 min，武火煮沸，文火慢煎90 min，提取2次，合并提取液，進行冷凍干燥，即得烏頭湯提取物凍干粉。

2.4 陰性對照液配制

分別取不含有上述各味藥材的復方4份，按2.3項下進行制備，即得各組陰性對照溶液。

2.5 樣品溶液前處理

取烏頭湯凍干粉0.2 g，加95%的甲醇5 mL，超聲提取30 min，于10 000 r/min，離心10 min取上清液，即得供試品溶液1；另取烏頭湯凍干粉2g，加入1 mol/L的鹽酸1 mL，10 mL乙醚超聲提取15 min，棄去乙醚液，再向殘渣中加入1 mL氨試液，10 mL乙醚萃取2次，合并萃取液，30℃氮氣吹干，1mL0.5%鹽酸甲醇定容，即得供試品溶液2。

3 實驗結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性考察取上述對照品溶液，陰性對照品溶液按2.1項下色譜條件進行檢測，結果見圖1和圖2。結果顯示各成分之間均無干擾，專屬性良好。

圖1 12種標準品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of twelve standard substances

圖2 烏頭湯陰性對照HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the wutou decoction negative control

3.1.2線性關系考察稱取上述對照品標準溶液0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、8mL和10mL于10mL容量瓶內，甲醇定容至刻度，配制成不同濃度的混合標準品溶液，進樣量5L，以各標準品峰面積為y軸，濃度為x軸繪制標準曲線，結果見表1，表明各成分在相應濃度范圍內線性良好。

表1 12種化合物線性方程及線性范圍Table 1 The calibration curves of twelve compounds

3.1.3 精密度實驗取混合對照品溶液，按上述2.1色譜條件連續進樣6次。計算各成分峰面積的RSD，考察儀器精密度。結果顯示鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿和甘草酸的RSD分別為0.32%、0.25%、0.46%、0.58%、0.36%、0.39%、0.42%、0.61%、0.52%、0.58%、0.46%和0.41%，表明該儀器精密度良好。

3.1.4 穩定性實驗精密量取同一供試品溶液，密閉置于室溫條件下，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h和24 h按2.1色譜條件進行測定，結果顯示鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿和甘草酸的RSD分別為2.56%、3.23%、2.21%、1.68%、2.06%、2.87%、3.26%、1.78%、2.32%、3.01%、2.75%和2.48%，表明供試品溶液放置24 h基本穩定。

3.1.5 重復性實驗精密稱取同一批供試品，按2.3項下的方法平行制備6份供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進行檢測，結果顯示鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿和甘草酸的RSD分別為1.96%、1.69%、1.56%、1.78%、2.06%、2.36%、3.04%、2.41%、1.89%、2.96%、1.78%和2.76%，表明該方法重復性良好。

3.1.6 加樣回收實驗精密量取0.2 g已知含量的供試品6份，各組分按1:1的比例分別精密加入一定量混合對照品，按2.3項下方法進行供試品制備，并按2.1項下色譜條件進行檢測。結果顯示鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿和甘草酸的平均回收率在90%~108%之間，RSD小于5%，表明各成分回收率良好。

3.2 含量測定

按照2.3項下方法制備3批供試品溶液，并按2.1項下方法進行檢測，計算每批樣品中各成分的含量，結果見表2。

表2 含量測定結果Table 2 The results of content determination mg/g

4 討論

現代醫學研究表明，烏頭湯成分復雜，具有多成分、多靶點的治療特點，現有分析方法無法采用同一條件對烏頭湯中各類成分進行統一有效地定量分析，而是根據不同化合物類型采用不同條件和方法進行測定[10,11]，其原因主要是由于組成烏頭湯的5味藥材基源各不相同，復方中有效成分包含生物堿類、黃酮類和萜類等多種結構類型，進而導致色譜分離過程中存在較大難度。尤其是生物堿類化合物，在液相分離過程中，往往伴隨著峰形拖尾和載樣量低等情況，導致色譜峰寬較寬，峰高較矮，色譜峰的分離不利以及靈敏度差等問題[12]。因此針對上述問題，本實驗開發一種高效液相色譜方法，用于烏頭湯有效成分的含量測定。

該方法首次將烏頭湯中不同結構類型的有效成分進行統一測定。通過對流動相pH及緩沖鹽進行篩選發現，當流動相pH呈酸性時，各成分峰形良好。而采用磷酸鹽作為緩沖鹽溶劑時，相較于醋酸銨等有機鹽，低波長下，紫外吸收明顯減弱，背景噪音影響最小，基線更為平順，進而有助于提高靈敏度。此外對比不同廠家、不同類型的色譜柱，最終確定Waters Xseclect C18作為本方法的色譜柱，其特點在于固定相表面具有雜化帶電顆粒，可與堿性化合物溶質間產生靜電排斥，阻止生物堿類化合物向硅醇基靠近，從而改善峰形拖尾[13]，進而避免向流動相中加入掃尾劑（如三乙胺）或使用堿性流動相等條件，影響其他類型化合物穩定性或降低色譜柱耐用性，而導致的檢測結果不穩定等問題[14]。優化上述條件并結合梯度洗脫，最終確立了本方法各項參數。與現有技術相比，該方法高效，省時省力，成本低廉，適用于科學研究及生產實踐，且穩定可靠，各成分間分離度良好，且與陰性對照液對比分析，無假陽性及干擾峰存在。此外該方法也同時將烏頭中容易引起中毒反應的毒性成分雙酯型烏頭堿（新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿）[15]一并納入檢測范圍，在對烏頭湯中9種有效成分進行定量分析的同時，也對3種毒性成分進行監測，確保在使用烏頭過程中，由于炮制不善等其他因素所導致的中毒反應，提高用藥安全性。

由于烏頭湯中成分復雜，各有效成分含量差異較大，因此本實驗采用兩種前處理方法進行樣品制備。方法1針對于麻黃堿、偽麻黃堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸及甘草苷等含量較高的成分。方法2則對于烏頭類生物堿進行樣品的除雜與富集[10]，通過酸化成鹽提高其水溶性的同時，乙醚萃取去除脂溶性雜質成分，進一步堿化使烏頭類生物得以游離，進而增加其在乙醚中的溶解性，提高萃取效率。采用該方法對工藝驗證樣品中的雙酯型生物堿進行測定，低于人體毒性反應的最低劑量0.2 mg[16]，符合用藥安全。經方法學考察驗證，該方法專屬性強，精密度、穩定性和重復性RSD均小于3%。加樣回收實驗中，各指標成分回收率在90%~108%，符合藥典相關規定，可為今后烏頭湯的質量標準研究和新劑型開發提供科學依據。