高效液相色譜聯用四極桿軌道阱質譜分析柏樹花粉過敏原蛋白

宋天園，道吉吉，夏建珍，王甜，肖蘭，崔箭，唐麗※

[1.民族醫藥教育部重點實驗室（中央民族大學），北京 100081；2.中央民族大學藥學院，北京 100081；3.中央民族大學附屬校醫院，北京 100081；4.北京協和醫學院護理學院，北京 100144]

柏科植物在我國有8屬29種，是傳統園林綠化樹種，其中以圓柏（Juniperus chinensis L.）最為常見，廣泛分布于全國（中國生物物種名錄2022版），同時柏樹花粉也是引發季節性過敏性鼻炎和哮喘等過敏性疾病主要誘因之一[1,2]。隨著生態綠化水平的提高和圓柏等柏科植物的廣泛應用，我國各地空氣中的柏樹花粉濃度也呈現較高的水平和很強的季節性特點。研究顯示，我國多個地區和城市的空氣監測中均報告含量較高的柏樹花粉[3-6]，尤其是在春季花粉季節，有的地區大氣中漂浮的柏樹花粉濃度可高達294 g/m3[3]。同時在臨床也相應出現了大量的花粉過敏患者并且呈現出逐年增長的趨勢[7-9]，尤其在一些以圓柏或柏樹綠化樹種占比較大的小區或綠地，周邊居民或人群往往在每年的3月中下旬至4月中旬期間集中高發季節性過敏性鼻炎和/或過敏性哮喘等疾病。臨床常見的癥狀表現主要有持續性的噴嚏和流涕不止、鼻腔堵塞甚至影響呼吸、眼睛分泌物增多和紅腫奇癢等，嚴重過敏患者出現哮喘、憋悶、聽力下降及視物昏花等癥狀，還有些過敏患者會出現皮膚瘙癢、紅腫等皮疹皮炎癥狀。

近年來，柏樹花粉過敏性疾病的流行病學、花粉變應原及致敏性評價、致敏機制等方面的研究越來越引起國內外學者的廣泛關注。在歐洲，法國和西班牙等國家的研究顯示柏樹花粉是冬春季節花粉癥的重要變應原[10,11]。我國學者也對柏樹花粉致敏開展了一些研究工作[12-15]。柏樹花粉變應原蛋白是其引發過敏反應的關鍵基礎，因而獲得純度高的柏樹花粉變應原蛋白可為其結構及表位、生物學特性、致敏性評價和檢測方法等方面的研究提供必要的材料。本實驗對柏樹花粉進行蛋白提取，應用LS-MS/MS方法對蛋白提取物進行蛋白質組學分析，鑒定其中主要致敏蛋白，為進一步開展柏樹花粉致敏蛋白的分離與鑒定、致敏性評價及相關檢測方法的開發與建立提供思路和參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

圓柏花粉，2022年4月柏樹花粉釋放盛期于中央民族大學校內采集，得到的花粉低溫干燥后4℃保存。

二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、碳酸氫銨、胰蛋白酶（測序級）和磷酸鹽緩沖溶液（PBS，Sigma），甲醇、乙腈和甲酸為色譜級和質譜級（Merck KGaA），鹽酸為優級純（Merck KGaA），蒸餾水（屈臣氏），3 kD超濾管（PALL），SCX tip（Thermo）。

1.2 儀器

花粉采集器（中國西安必勝電子科技有限公司），高效液相色譜系統（北京普源精電科技有限公司RIGOL L-3000），高分辨質譜儀（美國Thermo公司Q Exactive HF-X），真空離心濃縮儀（北京吉艾母科技有限公司CV100-DNA），渦旋振蕩器（SCILOGEX MX-S），離心機（Eppendorf，5804 R），酶標儀（DR200B），超聲破碎儀（上海滬析實業有限公司JY96-IIN），電熱恒溫水浴鍋（北京市光明醫療儀器有限公司XMTD-7000），KQ-500E型超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 花粉的采集和前處理

采用自然脫落法和使用花粉采集器，將采集到的圓柏花序和用花粉采集器采集到的花粉進行篩分去除雜質，低溫烘干后于4℃保存。

2.2 花粉粗蛋白浸液制備

去除雜質后收集到的干燥花粉按重量體積比1:20加入0.01 mol/L的PBS液，冰浴超聲波破碎15 min，再將所得花粉混懸液于4℃下連續攪拌24 h，然后于4℃、10 000 g下離心20 min，取上清液。將上清液用0.45m的濾器過濾，4℃保存[15,16]。

2.3 花粉蛋白提取富集

將上述得到的濾液用PALL 3 kD超濾管進行濃縮，4℃下4 500 g離心，得到超濾后的超濾濃縮液，4℃保存。

2.4 酶解

取適量蛋白加入終濃度為5 mM DTT，37℃孵育1 h，然后恢復室溫。加入終濃度為10 mM的碘乙酰胺，室溫避光孵育45 min。用25 mM碳酸氫銨將樣本稀釋4倍并按照蛋白和胰酶比例50:1加入胰酶進行溶液酶切，37℃孵育過夜；第2天加入甲酸調節pH小于3，終止酶切。

2.5 脫鹽與純化

使用C18脫鹽柱對樣本進行脫鹽處理，100%乙腈活化脫鹽柱，0.1%甲酸平衡柱體，加載樣本到柱上，使用0.1%甲酸洗滌雜質，再以70%乙腈洗脫，收集洗脫液；將洗脫液經SCX-tip處理得到純化的樣品[17]，冷凍干燥后于20℃保存。

2.6 色譜條件

將凍干的酶解樣品用0.1%（V/V）甲酸溶液復溶至0.4g/L，取20L進行液相色譜-質譜聯用分析，重復3次。

RIGOL L-3000 LC，ReproSil-Pur C18-AQ色譜柱（1.9m，1.5 mm 250 mm），流動相A水（0.1%甲酸），B乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脫，程序為0~5 min，8% B；5~35 min，12%B；35~44 min，30%B；44~45 min，40%B；45~59 min，95%B；59~60 min，99%B。流速：0.6 mL/min；柱溫：40℃；進樣量5L。

2.7 質譜條件

Q Exactive HF-X高分辨質譜儀，Nanospray FlexTM（NSI）離子源；離子傳輸管溫度275℃，鞘氣（N2）流速40 L/min，輔助氣（N2）流速10 L/min；離子噴霧電壓2.4 kV，透鏡電壓50 V；正離子掃描模式。應用Full MS/dd-MS2模式，質譜全掃描范圍為m/z 350~1 500，一級質譜全掃描分辨率設為120 000（200 m/z），C-trap最大注入時間為80 ms，AGC target為3 106；選取全掃描中離子強度TOPN=40的母離子使用高能碰撞裂解（HCD）方法碎裂，二級子離子全掃描分辨率設為15000（200m/z），AGC為5 104，最大注入時間為45ms，二級最低閾值104；Peptidematch打開；頂點激發，2~8s，肽段碎裂碰撞能量NEC/step設為27，生成質譜檢測原始數據（.raw）。儀器每7 d采用Pierce LTQ Velos ESI正離子校正溶液（美國Thermo公司）進行質量數校正。

2.8 數據采集分析與驗證

植物花粉蛋白的序列數據來自數據庫網站（Uniprot蛋白數據庫，Universal Protein，https://www.uniprot.org/），并下載為Fasta文件。將采集的肽質量圖譜（PMF）和二級質譜（MS/MS）數據信息通過導入Proteome Discover 2.4軟件（美國Thermo公司）進行搜索和計算匹配，檢索引擎為Sequest HT，參數設置為：最大漏切位點數2，肽段范圍5~120，母離子容差10-5，碎片離子容差0.02 Da，y和b離子權重均為1，鑒定得到肽段的置信度＞95%；Sequest HT評分值采用其搜索算法對蛋白匹配度打分，分值越高可信度越高。在SDAP蛋白數據庫（Structural Database of Allergenic Proteins，https://fermi.utmb.edu/SDAP/sdap_src.html） 中檢索匹配相關蛋白質，并提取匹配的蛋白質和肽段相關信息。驗證方法采用平行反應監測（PRM）模式，靶向篩查肽段覆蓋率和Sequest HT評分排名靠前的蛋白質，完成確證鑒定。

3 結果與討論

3.1 主要過敏原蛋白及肽段的鑒定

圓柏花粉蛋白提取物經胰蛋白酶進行溶液酶切處理后，其產物經LC-MS/MS分析，總離子流色譜圖見圖1，其中譜峰峰型良好，譜圖重現性好，數據采集穩定。以Sequest HT為搜索引擎，在SDAP蛋白質數據庫中，以PMF結合MS/MS模式搜庫，可匹配到37種花粉蛋白，見表1。

圖1 圓柏花粉蛋白酶酶解產物總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatography of protease hydrolysates from J.chinensis pollen

表1 圓柏花粉蛋白酶解產物中的蛋白質鑒定Table 1 Protein identification for protease hydrolysates from J.chinensis pollen

經HPLC-MS/MS分析得到的肽段序列數據在SDAP蛋白數據庫中檢索匹配和比對，得到蛋白質鑒定信息（表2），包括蛋白質的序列號、理論分子量、等電點以及蛋白質名稱和來源物種名稱。鑒定的37個蛋白質理論分子量范圍為13.1~105 kD，其來源包括圓柏Juniperus chinensis L.、刺柏Juniperus formosana Hayata、側柏Platycladus orientalis（L.）Franco和日本柳杉Cryptomeria japonica D.Don等。

表2 蛋白質鑒定結果Table 2 Protein identification results

3.2 與柏科花粉變應原一致的肽段

到目前，Uniprot蛋白數據庫（Universal Protein）中收錄的柏科花粉變應原蛋白有10種，分子量約在40 kD左右，均具有較強的變應原性和致敏作用，依據其活性可分為兩組。其中1組發現了7種，均具有果膠裂解酶活性，包括Cha o 1、Cry j 1、Cup a1、Cup s 1、Jun a 1、Jun s 1和Jun v 1；2組發現了3種，一般具有聚半乳糖醛酸酶活性，包括Cha o 2、Cry j 2和Jun a 2[18,19]。本實驗篩選出了3種蛋白（Q93X51、A0A808QQB8和A0A7R6H3R2）可滿足相關鑒定確證需求，即序列之間具有較高的相似性，可提取出具備典型特征的肽段，且具有較高的響應，3種蛋白的特征肽段圖譜見圖2。本實驗對圓柏花粉蛋白酶解產物的蛋白組學分析鑒定結果表明，圓柏花粉中含有分別與柏科花粉1組和2組變應原一致的肽段，序列一致的肽段、分子量及其一致性情況見表3。

表3 與柏科花粉1組和2組變應原一致的肽段Table 3 Peptide segments consistent with allergens of Cupressaceae pollen

圖2 3種蛋白（Q93X51、A0A808QQB8、A0A7R6H3R2）的特征肽段圖譜Fig.2 Characteristic peptide chromatography of three proteins Q93X51,A0A808QQB8 and A0A7R6H3R2

3.3 討論

除了表3中的序列相似肽段之外，本實驗對圓柏花粉蛋白酶解后的質譜分析也得到了其他肽段，這些肽段的序列與其他科屬植物蛋白的序列存在一定的相似性，其來源有可能是圓柏花粉變應原蛋白經酶解后生成的一些肽段，也屬于柏科花粉變應原蛋白序列，也有可能來源于非變應原蛋白的酶解肽段，在分子量上接近。已有的變應原分析研究文獻表明[19,20]，如果肽段序列之間的相似性超過30%，則提示其很有可能同源，當一個肽段的氨基酸序列與某個特定的變應原序列一致性大于50%時，則表明二者可能共享變應原表位或者具有交叉反應。本實驗的蛋白組分析表明這些肽段與其他科屬植物的蛋白序列存在較高的相似性，也從一定程度解釋了花粉變應原之間以及花粉與其他植物性變應原之間存在著廣泛的交叉過敏反應。

4 結論

本研究建立的HPLC-MS/MS分析檢測方法通過PMF+MS/MS搜索結合計算匹配，以及PRM模式的確證分析，鑒定了圓柏花粉中的3個過敏原蛋白，確證了圓柏花粉中含有1組和2組變應原蛋白。該方法可用于對溶液酶切法獲得的圓柏花粉蛋白肽段進行分析鑒定，為高效精準檢測鑒定花粉過敏原蛋白及其致敏性評價提供有效技術支持。本實驗結果可為花粉變應原的分析檢測提供參考，為開發高效的花粉變應原檢測技術、變應原預測及其潛在致敏風險評價提供參考和依據。