HPLC法測定蒙藥藍刺頭中7種有機酸的含量

趙磊，姜大成，王丹彧，馬彧※，王路宏※

（1.長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117；2.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000）

藍刺頭為菊科藍刺頭屬植物藍刺頭（Echinops latifolius Tausch.）的干燥頭狀花序，收錄于《衛生部藥品標準蒙藥分冊》中，蒙語稱作“扎日阿烏拉”，具有固骨質、接骨愈傷和清熱止痛的功效，用于骨折、骨熱、刺痛癥及瘡瘍等疾病[1]，分布于我國東北、內蒙古、甘肅、寧夏、河北、山西及陜西[2]，生于海拔120~2 200 m的山坡草地及山坡疏林下。據文獻報道藍刺頭中含有有機酸、黃酮和苯丙素類等化學成分[3-9]，其中有機酸類作為一種重要的生物活性物質，具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、保肝利膽、降血壓和降血脂等作用，是藍刺頭藥材中重要的藥效物質。現行《衛生部藥品標準蒙藥分冊》標準藍刺頭項下缺少含量測定項目，僅有一些文獻報道。李巖等[11]采用HPLC法測定藍刺頭及其制劑中芹菜素-7-O-葡萄糖的含量；周容等[12]采用HPLC法測定了新疆藍刺頭花乙醇提取物中蘆丁的含量，但尚未有學者對其有機酸含量測定方法進行深入研究。本研究建立藍刺頭中的7個有機酸類成分測定方法，簡便、可靠，為建立藍刺頭多指標質控標準提供科學依據。

1 儀器、試藥

1.1 儀器

1260型液相色譜儀配DAD檢測器（Agilent公司）；BT125D型電子天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠制造）；2001B型系列超純水器（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ-500DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號110753-202119，含量以96.3%計）、咖啡酸（批號110885-201703，含量為99.7%）、蘆丁（批號100080-202012，供HPLC法測定，含量為91.6%）、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號111782-201807，含量以94.3%計）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸（批號111894-202104，含量以95.1%計）由中國食品藥品檢定研究院提供；5-咖啡酰奎尼酸（批號MUST-16022403，含量大于98.0%）、3,4-二咖啡酰奎尼酸（批號MUST-16031612，含量大于98.0%）由成都曼斯特生物科技有限公司提供。水為純化水；三氟乙酸、乙腈、甲醇均為色譜純。收集到10批藍刺頭藥材，樣品經四平市食品藥品檢驗所趙磊主任藥師鑒定為菊科藍刺頭屬植物藍刺頭Echinops latifolius Tausch.的干燥頭狀花序，規定批號為LCT1~LCT10，見表1。

表1 藍刺頭樣品信息來源Table 1 Echinops latifolius sample source information

2 溶液的配置

2.1 混標對照品配置

精密稱取5-咖啡酰奎尼酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸對照品分別置于100 mL量瓶中，采用甲醇搖勻溶解，分別配制成質量濃度為101.1g/mL、102.6g/mL、96.1g/mL、94.5g/mL、96.1g/mL、100.3g/mL、95.5g/mL的7種成分對照品儲備液。分別精密吸取上述對照品溶液10mL、5mL、5mL、5mL、5 mL、20 mL、10 mL置同一個100 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋成為10.11g/mL、5.13g/mL、4.80g/mL、4.72g/mL、4.80g/mL、20.06g/mL、9.55g/mL的混標對照品溶液，搖勻，即得。

2.2 樣品溶液制備

精密稱定藍刺頭粉末0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放置室溫后再稱定重量，采用50%甲醇補足蒸發的重量，混勻后過濾，用0.45m微孔濾膜濾過，即得。

3 色譜條件

流動相為乙腈（A）-0.08%三氟乙酸水溶液（B），進樣量為10L，流速為1.0 mL/min，檢測波長為325 nm。色譜柱為Waters HSS T3 C18（4.6 mm 250 mm,5m）。梯度洗脫見表2。

表2 藍刺頭7種成分測定梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for the determination of seven components of Echinops latifolius sample

4 測定法

圖1 藍刺頭中7種成分的色譜圖Fig.1 HPLC of 7 Components in Echinops latifolius

5 系統適用性試驗

5.1 線性關系考察及檢測限與定量限

精密吸取各對照品儲備液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、1 mL、2.0 mL和5.0 mL分別置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度作為混標溶液。分別精密吸取各系列濃度混標溶液及對照品儲備液各10L測定，分別以7種對照品的質量濃度（g/mL）為橫坐標，采用峰面積為縱坐標，得到線性方程。稀釋對照品溶液后進樣測定，當信噪比為3時測定檢測限，當信噪比為10時測定定量限。檢測結果見表3。

表3 7種測定成分的標準曲線方程、線性范圍、相關系數及檢出限與定量限Table 3 Standard curve equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 7 determined components

5.2 精密度考察

5.3 重復性考察

取樣品粉末（LCT1樣品）6份，分別按照供試品溶液制備方法制備，按照色譜方法測定，計算含量。結果各份供試品溶液的5-咖啡酰奎尼酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸的測定結果RSD（n=6）分別在1.38%~1.96%，結果表明重復性良好。

5.4 穩定性考察

取同一供試品溶液（LCT1樣品溶液），分別于0h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h進樣測定。結果5-咖啡酰奎尼酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸的峰面積的RSD（n=6）分別在0.68%~1.13%，結果表明樣品溶液在24 h內穩定。

5.5 回收率考察

取已知含量得藍刺頭樣品（LCT1樣品）粉末6份，每份約0.15 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入近等量得各對照品溶液，分別按照供試品溶液方法制備，按色譜方法測定，計算回收率，結果5-咖啡酰奎尼酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸平均加樣回收率（n=6）分別在97.89%~99.67%，RSD分別在1.54%~2.11%，表明回收率良好。

5.6 藍刺頭7種成分含量測定

測定LCT1~LCT10批樣品，分別按供試品溶液制備方法制備。精密吸取各供試品溶液10L，按上述色譜條件進行測定，采用外標法計算百分含量，結果見表4。

表4 藍刺頭中7種成分含量測定結果Table 4 Content determination results of 7 components in Echinops latifolius %

6 討論

6.1 色譜條件的選擇

采用高效液相色譜法測定藍刺頭中的7種主要化學成分，5-咖啡酰奎尼酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸分離度良好，50 min完成測定，結合文獻查詢，結果采用325 nm時7種化學成分均有較大吸收，雜質峰干擾較少，故采用325 nm波長進行檢測。流動相經多種流動相體系測定，結果顯示乙腈-0.08%三氟乙酸為流動相分離效果好，色譜峰理論板數較高，峰形對稱。

6.2 含量測定

本實驗在同一色譜條件下，同時測定不同批次藍刺頭中綠原酸、4-咖啡酰奎尼酸、咖啡酸、蘆丁、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸7種有效成分的含量，方法簡便、快速、準確，為有效控制藍刺頭的質量提供了科學依據。測定的10批藥材中綠原酸與3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量結果差異較大，可能因為樣本與產地、采收期及儲存時間都有密切的關系，并且綠原酸和咖啡酰基成分也不太穩定。