微波水解全自動氨基酸分析法測定黃精中的氨基酸含量

孫紫薇，宋超，崔麗麗，畢融冰，王玉方，劉繼永，趙卉

（中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

黃精為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum Mill）植物滇黃精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）和多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖[1,2]。根據其形態特征，可將其分為大黃精、雞頭黃精和姜形黃精。黃精常見于中醫藥典籍中，藥用價值較高，具有潤肺、益腎和補氣養陰等功效，被用于治療胃陰不足、勞嗽咳血、脾胃氣虛及體倦乏力等病癥[3,4]。近些年來，由于人們對黃精關注度不斷提高，研究不斷深入，已經從黃精中分離出生物堿、木質素、甾體皂苷、多糖、維生素和氨基酸等多種有效成分，其中氨基酸被認為是黃精補益和增加免疫功能的物質基礎[5]。劉延東等[6]、吳毅等[7]及王曙東等[8]對不同生長期、不同炮制品及不同部位黃精中的氨基酸含量進行了分析研究，但多采用前處理耗時長、操作工序復雜的高溫加熱水解法。1975年，Abu-samra等[9]首次采用微波技術，通過快速轉換電磁場中的微波頻率來改變樣品中極性分子的取向，增加分子間碰撞能量，將密閉容器變成高溫高壓環境，從而提高蛋白質水解效率。近年來，微波消解法憑借其耗時短、成本低和高效率等特點被廣泛地用于水解各種樣品蛋白質[10]。

本文通過優化微波水解時間和溫度等關鍵條件，進而考察高溫加熱水解法與微波消解法在水解黃精樣品中產生的差異性，結合全自動氨基酸分析儀建立一種快速且高效的黃精中氨基酸的檢測方法。

1 儀器、材料與試劑

L-8900全自動氨基酸分析儀（日本Hitachi公司）；SW-4微波消解儀（德國Berghof公司）；Milli-Q Advantage A10超純水器（美國Millipore公司）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）；DZF-6090真空烘箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；MS204S電子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器設備有限公司）；JP-100ST超聲清洗機（廣州市潔盟超聲波清洗設備有限公司）；MX-S可調式混合儀（大龍興創實驗儀器有限公司）。

黃精由中國農業科學院特產研究所吉林省左家鎮藥用植物資源圃提供，經特產所劉繼永研究員鑒定為百合科黃精屬黃精（Polygonatum sibiricum）的根莖。

試劑：鹽酸（北京化工廠，優級純）；苯酚（國藥集團，分析純）；氨基酸混合標準液（H型，日本Woke公司）；超純水（電阻率≥18.2）。

2 方法

2.1 氨基酸混合標準溶液配制

2.2 前處理方法

樣品經高速粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

常規水解法：稱取0.1 g樣品于水解管中，準確加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，將水解管放入冷凍劑中冷凍5 min，抽真空后充入氮氣，重復抽真空 充入氮氣3次后，在充氮氣狀態下擰緊螺絲蓋，110℃恒溫干燥箱水解22 h，水解液冷卻至室溫后將其全部過濾至50 mL容量瓶內，超純水定容。準確吸取1.0 mL水解液于玻璃試管中，70℃減壓干燥，用2.0mL0.02mol/L的鹽酸溶液復溶，渦旋混勻，過0.22m水系濾膜，上機待測。

微波水解氨基酸法：稱取0.1 g樣品于專用微波消解罐中，準確緩慢加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，消解罐密封，按試驗設計設定微波消解儀的溫度和時間，進行消解。消解結束后，待水解液冷卻至室溫后，將全部水解液過濾至50 mL容量瓶內，超純水定容。準確吸取1.0mL水解液于玻璃試管中，70℃減壓干燥，用2.0 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液復溶，渦旋混勻，過0.22m水系濾膜，上機待測。

2.3 儀器工作參數

色譜柱：4.6 mm id 60 mm；填充物：磺酸型陽離子樹脂；檢測波長：570 nm、440 nm；進樣量：20L；泵1流速：0.1 mL/min，泵2流速：0.1 mL/min；

色譜條件：全自動氨基酸分析儀色譜條件見表1，其中B1-B4為檸檬酸鈉、檸檬酸、氯化鈉、氫氧化鈉和乙醇按一定比例混合配制成的pH分別為1、2、3、4的緩沖溶液，用于將陽離子交換柱上的氨基酸按吸附力強弱在不同時間洗脫出來，達到分離氨基酸的目的。洗脫下來的氨基酸則與茚三酮反應液（R1-R3）在135℃加熱的條件下反應，分光光度計于570 nm和440 nm測定，外標法定量。

表1 色譜條件Table 1 The chromatographic conditions

續表

3 結果與討論

3.1 常規水解法與微波水解法的結果比較

采用“2.2”中的2種氨基酸水解方法處理同一個黃精樣品，結果顯示，除胱氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸及賴氨酸的檢出量微波水解測定值略低于常規水解外，其他氨基酸含量基本相同；常規水解與微波水解法所測得的氨基酸總量分別為5.75%和5.60%，差值不足0.2%，微波水解的前處理方法完全能夠滿足黃精中氨基酸含量測定的要求，且與常規方法相比能夠節省提取時間，提高工作效率，因此，黃精中氨基酸含量測定可選擇微波水解法，見圖1。

圖1 常規水解與微波水解的比較Fig.1 Comparison of conventional hydrolysis and microwave hydrolysis

3.2 微波水解條件優化

3.2.1 微波水解溫度優化 在微波功率1 000 W、水解時間18 min固定不變的情況下，分別考察水解溫度為130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃時野生黃精樣品中各氨基酸含量的變化情況。結果見表2：總氨基酸含量隨水解溫度的升高逐漸增大，170℃時總氨基酸含量達到最大，為5.573 2 g/100 g，溫度繼續升高至200℃時總氨基酸含量逐漸降低至5.390 8 g/100 g。其中天冬氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸在溫度升高過程中檢出量明顯增大，170℃時達到最高，高于170℃后逐漸平穩。

表2 不同微波水解溫度條件下的氨基酸含量Table 2 The content of amino acid under different microwave hydrolysis temperature

結果顯示，隨著溫度的升高，氨基酸檢出量呈現出先上升后下降的趨勢。其中，胱氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的檢出量受溫度影響較大，隨著溫度的升高，5種氨基酸的檢出量逐漸升高；170℃時，其氨基酸的檢出量最大；溫度繼續升高，這些氨基酸在一定程度上被破壞，檢出量不斷降低；其他氨基酸檢出的結果受影響程度不明顯。因此，確定170℃為微波水解氨基酸的最佳溫度。

3.2.2 微波水解時間優化功率1 000 W、水解溫度170℃的情況下，分別考察8min、10min、12min、14min、16 min、18 min、20 min和22 min條件下氨基酸含量的變化情況。結果顯示，隨著其微波水解的時間不斷延長，谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸出現了先升高后降低的變化，當水解時間為14 min時，檢出量最大。因此，選擇最佳微波水解時間為14min。

3.3 方法的精密度、穩定性及重復性

取“2.2”項下微波消解法（微波功率1 200 W，水解溫度170℃，水解時間14 min）制備的供試樣品溶液，經過連續進樣6次，17種氨基酸的相對標準偏差RSD（n=6）范圍為0.26%~2.7%。將上述供試樣品室溫下存放0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后測定17種氨基酸峰面積的RSD（n=7）＜4.2%。取同一黃精樣品，按“2.2”微波消解法（微波功率1 200 W，水解溫度170℃，水解時間14 min）制備6份供試樣品溶液，測定各氨基酸色譜峰面積，RSD%（n=6）為0.21%~3.6%；氨基酸總量平均值為5.71 g/100g，RSD%為0.51%。上述結果表明，該方法的穩定性好、精密度高、重現性良好，能夠用于黃精中的17種氨基酸的檢測分析。

3.4 加標回收率

準確稱取6份0.1 g（精確至0.000 1 g）黃精樣品，加入一定量氨基酸的混合標準溶液，利用微波水解法檢測氨基酸的含量，計算其回收率。如表2所示，黃精中各氨基酸的平均加標回收率在83.0%~108.2%之間，RSD%（n=6）為0.51%~3.91%。該方法測定黃精中氨基酸含量的加標回收率良好，準確性高。

表3 水解黃精中的17種氨基酸的含量、回收率及相對標準偏差Table 3 The contents，recoveries and RSD of 17 kinds of amino acids in Polygonatum sibiricum

3.5 野生黃精與林下黃精氨基酸含量測定

采用微波水解法，通過全自動氨基酸分析儀分別測定了野生黃精和林下黃精的氨基酸含量，結果顯示，野生黃精氨基酸含量高于林下黃精，總量分別為5.60%和4.15%，其中精氨酸的含量最高，分別為1.70%和1.23%，占氨基酸總量的25%以上。

4 結論

本試驗采用加熱水解法和微波水解法測定了黃精中17種氨基酸的含量，并對結果進行了對比分析。研究表明，黃精樣品在微波功率為1 200 W、170℃條件下微波水解14 min時，可與常規加熱水解法達到相同的效果，且該方法操作簡單、耗時短且安全性高，可以有效降低檢測成本。微波水解法測定黃精中17種氨基酸的準確度、重現性和穩定性都很好，可用于黃精和其他中藥材中的氨基酸檢測。