安神飲對(duì)失眠小鼠的藥效學(xué)研究

丁勻喬，袁名揚(yáng)，李新，蔣蕾，王娜，楊波※，彭海生※

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)，黑龍江 大慶 163319）

失眠（Insomnia）為一種睡眠質(zhì)量差或睡眠持續(xù)時(shí)間嚴(yán)重不足的精神障礙類疾病[1]，表現(xiàn)為多夢(mèng)、不易入睡、夢(mèng)中不安、易醒及醒后難以入睡[2]等。長(zhǎng)期失眠不僅對(duì)患者的工作、生活產(chǎn)生影響，而且還會(huì)損害身心健康，誘發(fā)抑郁、心腦血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病。Zheng等[3]開展的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)城市居民自報(bào)失眠癥狀的發(fā)病率為4%~48%，而農(nóng)村居民的失眠發(fā)病率超過20%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年超過1/3的成年人受到失眠的困擾，且失眠的發(fā)生率逐年上升且趨向年輕化[4]。目前臨床多采用服用藥物來治療失眠，常見的西藥如地西泮、唑吡坦等，雖起效快、效果明顯，但隨之而來的藥物成癮、耐藥等[5]一系列不良反應(yīng)也對(duì)患者產(chǎn)生困擾；中藥主要以滋陰補(bǔ)氣、養(yǎng)心安神和調(diào)理機(jī)體來緩解失眠，常用方劑如歸脾湯、棗仁安神顆粒及梔子豆豉湯[6,7]等都具有良好的安神作用且無不良反應(yīng)，因此選擇中藥治療失眠已成為越來越多人的首選治療方案。

本文所選安神飲為民間經(jīng)驗(yàn)方，由歸脾湯[8]與四君子湯[9]加減化裁而成，由當(dāng)歸、合歡皮、龍眼肉、夜交藤、煅龍骨、生曬參、五味子和炒山藥等數(shù)味中藥組成，具有補(bǔ)中益氣、安神養(yǎng)心的功效，可治療神疲乏力、失眠及氣血虧損等癥。課題組前期已經(jīng)對(duì)安神飲進(jìn)行處方優(yōu)化得出最佳提取工藝，本文通過對(duì)PCPA誘導(dǎo)得到的失眠小鼠進(jìn)行安神飲不同劑量給藥治療，觀察小鼠治療前后的精神狀態(tài)、體重變化、自主活動(dòng)變化、記錄睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間，并通過HE染色觀察失眠小鼠治療前后下丘腦組織病理變化，探究安神飲對(duì)PCPA所致失眠小鼠的作用效果，為臨床使用提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠72只，6~8周齡，體重（20±2）g，[長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（吉）2020-0001]，正常飼養(yǎng)，溫度20~25℃，濕度40%~60%，晝夜循環(huán)正常。

1.2 試藥

當(dāng)歸、炙遠(yuǎn)志、杜仲、炒白術(shù)（批號(hào)：200801），生曬參、茯神（批號(hào)：211101），合歡皮、煅龍骨（批號(hào)：210701），龍眼肉（批號(hào)：150713），夜交藤、炒酸棗仁（批號(hào)：201201），煅牡蠣（批號(hào)：210501），炒山藥、黃芪（批號(hào)：210101），五味子（批號(hào)：210901），飲片均購(gòu)自哈爾濱普方藥業(yè)；艾司唑侖（山東信誼，210501）；PCPA（阿拉丁科技，C136727）；戊巴比妥鈉（Sigma公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

低速離心機(jī)（黑龍江禾文科技，eppendorf 543OB），小鼠自主活動(dòng)儀（成都泰盟），倒置熒光顯微鏡（DMI 300OB），電子天平（龍騰電子，F(xiàn)H2004A），壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，DSX-28OB）

2 方法

2.1 安神飲的制備

按處方稱取所需中藥材，加藥材總重6倍量的水浸泡30min，與高壓蒸汽滅菌器中蒸煮2次，每次1.5 h，合并煎液，濃縮，過濾，離心（4 000 r/min，5 min），上清液加水定容至100 mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物模型建立

動(dòng)物正常飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境7 d后，于每天固定時(shí)間，模型組與治療組連續(xù)2 d腹腔注射400 mg/kg PCPA混懸液（PCPA混懸液為粉末加水配成30 mg/mL即得），對(duì)照組注射等體積生理鹽水，2 d后觀察各組狀態(tài)，除對(duì)照組外小鼠出現(xiàn)晝夜紊亂、相互攻擊等現(xiàn)象，表明失眠模型建立成功。

2.3 動(dòng)物分組及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，每組12只，分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性給藥組、安神飲低5.33 g/kg、中10.66 g/kg、高21.32 g/kg劑量給藥組。造模2 d結(jié)束后，各組進(jìn)行給藥，對(duì)照組與模型組連續(xù)7 d生理鹽水灌胃；陽(yáng)性給藥組連續(xù)7 d艾司唑侖（0.1 mg/kg）灌胃；安神飲給藥組連續(xù)7 d安神飲灌胃。給藥劑量根據(jù)動(dòng)物與人給藥劑量換算即得。

2.4 行為狀態(tài)觀察及體重變化測(cè)定

觀察各組小鼠成模與治療后的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)和糞便等，并記錄小鼠造模前后及最后一次給藥后的體重，計(jì)算增加率。

2.5 對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

于造模前后及最后一次給藥30 min后將小鼠按分組放于自主活動(dòng)儀中，適應(yīng)環(huán)境3min，測(cè)定小鼠5min內(nèi)活動(dòng)與站立次數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)前后需清潔儀器內(nèi)部以防影響實(shí)驗(yàn)。

2.6 睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間的測(cè)定

每組各取6只小鼠于最后一次給藥1 h后，按小鼠體重腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥鈉，記錄小鼠睡眠潛伏期與睡眠時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)期間需保持安靜。

2.7 HE染色

將最后一次進(jìn)行自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)的各組小鼠于結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死，在冰盒上取下丘腦，用生理鹽水沖洗干凈，用4%多聚甲醛固定，在30%蔗糖溶液中沉糖，包埋、冰凍切片，HE染色，光鏡下觀察小鼠下丘腦組織形態(tài)學(xué)變化并攝片。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 行為狀態(tài)及體重變化結(jié)果

造模后各組小鼠狀態(tài)出現(xiàn)明顯不同。空白組小鼠精神正常，晝夜節(jié)律明顯；模型組小鼠暴躁易怒、相互攻擊、對(duì)外界刺激敏感、糞便軟且灰白；治療后各組小鼠狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常。對(duì)照組小鼠體重持續(xù)平穩(wěn)增加，其余各組小鼠體重呈先降低后增加趨勢(shì)，結(jié)果見表1。與對(duì)照組相比，模型組小鼠體重增加不明顯（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性給藥組與安神飲中、高劑量給藥組小鼠體重增加極為明顯（P＜0.01），說明安神飲對(duì)失眠小鼠體重增加率下降具有抵抗作用。

表1 安神飲對(duì)失眠小鼠體重影響（n=6）Table 1 Effects of Anshenyin on the body weight of insomnia mice(n=6) g

3.2 對(duì)小鼠自主活動(dòng)影響結(jié)果

從表2中可以看出，對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)前后活動(dòng)正常。造模后，與同組造模之前比較，除陽(yáng)性藥組與安神飲高劑量組外，各組失眠小鼠活動(dòng)次數(shù)顯著增加（P＜0.05），站立次數(shù)極顯著增加（P＜0.01）；陽(yáng)性藥組與安神飲高劑量組活動(dòng)次數(shù)有所降低，但站立次數(shù)增加明顯，故不影響實(shí)驗(yàn)。治療后，與同組造模后比較，各組小鼠活動(dòng)普遍降低，其中陽(yáng)性給藥組、安神飲中、高劑量給藥組小鼠活動(dòng)次數(shù)與站立次數(shù)極顯著降低（P＜0.01）。同時(shí)與造模前相比，治療結(jié)束后各組小鼠自主活動(dòng)均有不同程度降低。說明，安神飲可降低失眠小鼠自主活動(dòng)，為其鎮(zhèn)靜安神作用提供依據(jù)。

表2 安神飲對(duì)失眠小鼠自主活動(dòng)的影響（n=6）Table 2 Effect of Anshenyin on autonomic activity of insomnia mice(n=6)

3.3 睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間結(jié)果

由表3可以看出，與對(duì)照組相比，模型組小鼠睡眠潛伏期極顯著增加（P＜0.01），睡眠時(shí)間極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，安神飲低劑量給藥組小鼠睡眠潛伏期顯著降低（P＜0.05），睡眠時(shí)間顯著增加（P＜0.05），其余給藥組較低劑量組效果更為明顯（P＜0.01）。表明安神飲對(duì)失眠小鼠具有縮短其睡眠潛伏期、延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的作用。

表3 安神飲對(duì)睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間的影響（n=6）Table 3 The effect of Anshenyin on sleep latency and sleep time in mice(n=6) min

3.4 HE染色結(jié)果

如圖1所示，對(duì)照組小鼠下丘腦細(xì)胞排列緊密，胞體之間界限清楚、無損傷；模型組小鼠下丘腦細(xì)胞損傷嚴(yán)重，數(shù)量少，細(xì)胞間隙變大、排列紊亂、無明顯界限，細(xì)胞明顯呈空泡樣；治療后，各給藥組小鼠下丘腦組織病理狀態(tài)均出現(xiàn)不同程度好轉(zhuǎn)，陽(yáng)性給藥組及安神飲高劑量給藥組小鼠下丘腦細(xì)胞已接近對(duì)照組狀態(tài)。

圖1 失眠小鼠治療前后下丘腦HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining results of hypothalamus in insomnia mice before and after the treatment

4 討論

失眠為導(dǎo)致睡眠覺醒系統(tǒng)紊亂的神經(jīng)性疾病，中醫(yī)多認(rèn)為失眠是由“外感”、“內(nèi)傷”導(dǎo)致心神不寧、陰陽(yáng)失調(diào)，多用中藥對(duì)五臟六腑進(jìn)行調(diào)理，采用“陰陽(yáng)調(diào)和”、“情緒放松”等協(xié)助治療失眠[10]。本文所用安神飲為民間經(jīng)驗(yàn)方，目前尚無相關(guān)研究，因此課題組前期對(duì)其進(jìn)行處方篩選與劑型選擇，將此制為合劑。本文將安神飲進(jìn)行灌胃治療，對(duì)失眠小鼠進(jìn)行一系列研究，證明其鎮(zhèn)靜安神作用，為日后臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

腹腔注射PCPA混懸液為國(guó)際公認(rèn)的建立失眠模型的最佳方法[11]，相比于其他方法，此方法造模穩(wěn)定、時(shí)間快（一般為連續(xù)注射2~3 d）、省時(shí)省力且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。5-HT為參與機(jī)體睡眠覺醒環(huán)節(jié)的重要遞質(zhì)，是不可或缺的睡眠調(diào)節(jié)因子，其含量與失眠、焦慮等疾病呈負(fù)相關(guān)[12]。PCPA為腦內(nèi)合成5-HT關(guān)鍵限速酶——色氨酸羥化酶（TPH）的抑制劑[13]，注射PCPA混懸液可導(dǎo)致5-HT含量降低，致使失眠。本文建立失眠小鼠模型中，選擇不同濃度PCPA混懸液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定為400 mg/kg，連續(xù)注射2 d為效果最佳，且制備混懸液過程中需要加入10%阿拉伯膠助溶，否則混懸液會(huì)出現(xiàn)分層無法使用。觀察小鼠體重變化分析到，失眠小鼠不經(jīng)治療隨時(shí)間增長(zhǎng)體重也會(huì)有所增加，考慮可能為PCPA有效時(shí)間影響自身失眠癥狀也會(huì)有所緩解但微乎其微。自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)為經(jīng)典的失眠實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法，小鼠自主活動(dòng)的降低與否可直觀反映藥物的鎮(zhèn)靜作用，證明中樞神經(jīng)興奮降低，自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中模型組不經(jīng)治療活動(dòng)也有所降低，也與PCPA有效時(shí)間有一定關(guān)系，但影響不大，給藥治療前后對(duì)比明顯。戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)為側(cè)面輔助證明催眠藥物藥效的實(shí)驗(yàn)方法，給藥治療后經(jīng)注射閾上劑量的戊巴比妥鈉，通過觀察動(dòng)物睡眠潛伏期與睡眠時(shí)間，從而證明藥物具有鎮(zhèn)靜催眠功效。

因此，本文通過一系列實(shí)驗(yàn)，證明安神飲可提高失眠小鼠體重增長(zhǎng)率、降低失眠小鼠自主活動(dòng)、縮短其睡眠潛伏期、延長(zhǎng)睡眠時(shí)間并可改善失眠小鼠下丘腦組織損傷，具有良好的鎮(zhèn)靜安神效果，為日后臨床使用奠定基礎(chǔ)。但本文對(duì)安神飲治療失眠的具體機(jī)制尚未探討，其通過何種通路發(fā)揮作用還不清楚，需要課題組日后繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行研究。