不同病理類型闌尾炎兒童患者的腸道菌群多樣性分析

劉園園 努爾買買提 王亞勇 周京濤

1新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院（烏魯木齊 830028）；2新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院（烏魯木齊 830028）

闌尾炎發(fā)生是由闌尾管腔阻塞、細菌入侵、闌尾畸形等因素綜合造成的，可發(fā)生在任何年齡。根據臨床過程可分為4 種病理類型：急性單純性闌尾炎、急性化膿性闌尾炎、壞疽性及穿孔性闌尾炎、闌尾周圍膿腫［1］。主要病因是由病原菌感染、淋巴濾泡過度增生及闌尾腔內糞石造成的梗阻而產生的炎癥。有研究［2］表明急性闌尾炎發(fā)病首要因素為病原菌感染，厭氧菌多樣性的增加和芽孢桿菌、核芽孢桿菌和疣狀芽孢桿菌的易位與急性闌尾炎的進展有關。認識感染灶部位的菌群多樣性就顯得尤為重要。目前臨床多采用闌尾腔內分泌物進行細菌培養(yǎng)及藥敏試驗來指導臨床抗菌藥物的合理使用。但是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以模擬菌群自然生長條件，檢出率低且嚴重低估了感染性疾病病原菌的種類和數量，病原學資料是否全面地反映了感染灶菌群情況值得進一步探討，因其結果會影響到感染性疾病病原菌的診斷和治療方案的制定［3-4］。本研究采用16S rRNA 基因測序測定兒童急性闌尾炎手術患者闌尾腔分泌物，通過對兒童闌尾炎患者不同病理類型闌尾內容物菌群的多樣性分析，為闌尾炎發(fā)病機制的組織病原學研究提供新的思路，為臨床制定個性化治療提供理論支持，從而達到避免抗菌藥物不合理使用引發(fā)菌群失調的目的。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2020年6-12月期間收治的闌尾炎兒童患者12 例，其中男3 例，女9 例。年齡5 ～16 歲，中位年齡11.5 歲。12 例患者中有5 例少數民族患者。手術組織病理證實為單純性闌尾炎6 例和化膿性闌尾炎6 例。入選標準：（1）闌尾炎經組織病理學檢查確診，均為兒童患者；（2）術前均使用頭孢西丁鈉一組抗感染治療；（3）無其他腸道疾病。排除標準：（1）術前使用不同種抗菌藥物治療患者；（2）合并其他疾病者；（3）資料不全者。本研究通過本院倫理委員會關于開展臨床研究審批（審批號：20221101-LW01），就整個實驗流程各項細節(jié)及以后的數據公布等事宜征得志愿者監(jiān)護人同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法 由外科醫(yī)生手術切除闌尾，在無菌環(huán)境下用生理鹽水擦拭表面滲出物，清洗切口。沿縱軸解剖闌尾組織，用無菌棉簽擦拭收集闌尾腔內的所有內容物，并置于無菌收集管中。收集完畢后迅速放入無菌冰盒，轉運至-80 ℃冰箱中，備后續(xù)分析。

1.2.1 內容物DNA 提取 使用MN NucleoSpin 96 SoiDNA 提取試劑盒提取患者闌尾腔內容物微生物組全基因組DNA 提取，并測定DNA 的數量和質量。

1.2.2 PCR 擴增 16S rRNA 基因 測 序V3-V4 高變區(qū)擴增，上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。Solexa PCR（20 μL 體系）：目的區(qū)域PCR 純化產物5 μL，上、下游引物各2.5 μL，高保真酶10 μL。PCR 反應條件：98 ℃30 s；98 ℃10 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，共10個循環(huán)；72 ℃5 min。定量后使用Illumina Novaseq 6000 平臺測序。在相似性97%的水平上對序列進行聚類，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU。對可執(zhí)行OTUs 聚類進行菌群豐度、構成、群落結構、多樣性等分析，測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學分析 序列數據分析應用QIIME2 和R 語言包。應用QIIME2 計算OTUs 水平Alpha 多樣性指數，比較樣本間的OTU 豐度和均勻度。通過R 語言中的vegan 包對不同樣本的微生物群落結構進行Beta 多樣性分析，使用python繪圖。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，針對細菌豐度的比較，采用Kruskal-Wallis檢驗進行統(tǒng)計分析，P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樣本病原學檢查 手術組織病理證實為單純性闌尾炎6 例和化膿性闌尾炎6 例，均在術中取闌尾內容物進行病原學檢查，包括需氧菌培養(yǎng)和厭氧菌培養(yǎng)。單純性闌尾炎組僅有2 例培養(yǎng)出具體病原菌，1 例為大腸埃希菌，1 例為肺炎克雷伯菌；化膿性闌尾炎組培養(yǎng)出2 例大腸埃希菌。12 例樣本僅檢出4 例，檢出率為33.33%。

2.2 樣本測序數據 下機數據tags、有效數據及OTUs 滿足測試要求，使用Usearch 軟件在97.0%的相似度水平下進行聚類，共獲得816 個OTUs，其中單純性闌尾炎組808 個，化膿性闌尾炎組659 個，兩組共有的OTUs 641 個，單純性闌尾炎特有的OTUs 有167 個，化膿性闌尾炎特有的OTUs 有18 個。

2.3 Alpha 多樣性分析 單純性闌尾炎組與化膿性闌尾炎組的Chao1、Shannon、Simpson 指數比較，單純性闌尾炎組Chao1、Shannon、Simpson 指數分別為（608.67±95.49）、（5.92±0.76）、（0.95±0.02），化膿性闌尾炎組分別為（475.82±45.19）、（4.16±0.67）、（0.88±0.05），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明兩組在物種豐度和物種多樣性上存在差異（圖1）。

圖1 Alpha 多樣性分析Fig.1 Alpha diversity analysis

2.4 Beta 多樣性分析 采用PERMANOVA/Anosim分析對樣本進行Beta 多樣性分析，Beta 距離越大表示分組差異越大，R 值越接近1 表示組間差異越大于組內差異，P ＜0.05 時說明檢驗的可信度高；兩組樣本測得R=0.344，P=0.02，樣本間差異明顯，組間差異大于組內差異，且差異有統(tǒng)計學意義（圖2）。

圖2 PERMANOVA/Anosim 分析Fig.2 PERMANOVA/Anosim analysis

2.5 組間菌群結構差異性分析 從分析進化圖可看出兩組闌尾炎患者的闌尾組織內容物在門、綱水平無明顯差異，在目、科、屬、種水平存在統(tǒng)計學差異（圖3）。在科水平Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Ruminococcaceae（瘤胃菌科）、Fusobacteriaceae（梭桿菌科）三個存在差異，單純性闌尾炎組Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 居多，化膿性闌尾炎組Fusobacteriaceae 居多。兩組在需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的構成上存在統(tǒng)計學差異，具有各自獨立的科。需氧菌中單純性闌尾炎組具有Lactobacillaceae（乳桿菌科），而化膿性闌尾炎組具有Alcaligenaceae（產堿桿菌科）和Campylobacteraceae（彎曲菌科螺桿菌科）。厭氧菌的構成上，化膿性闌尾炎具有Fusobacteriaceae、Peptostreptococcaceae（消化鏈球菌科）、Porphyromonadaceae（紫單胞菌科）、Veillonellaceae（韋榮氏球菌科）、Tissierellaceae（組織菌科）。兼性厭氧菌的構成上，單純性闌尾炎具有Pasteurellaceae（巴斯德氏菌科）、Streptococcaceae（鏈球菌科），見圖4。在屬水平Faecalibacterium（糞桿菌屬）、Agathobacter（直腸真桿菌屬）、Bilophila（嗜膽菌屬）三個存在顯著性差異，單純性闌尾炎組Faecalibacterium、Agathobacter居多，化膿性闌尾炎組Bilophila 居多。兩組在需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的構成上存在統(tǒng)計學差異，具有各自獨立的屬。需氧菌中單純性闌尾炎組具有Lactobacillus（乳酸桿菌屬），而化膿性闌尾炎組具有Campylobacter（彎曲桿菌屬）和Sutterella（薩特氏菌屬）。厭氧菌的構成上，單純性闌尾炎具有Ruminococcaceae、Blautia（布勞特氏菌屬）、Faecalibacte-rium，化膿性闌尾炎具有Fusobacterium、Parvimonas（微單胞菌屬）、Peptostreptococcus（消化鏈球菌屬）、Porphyromonas（卟啉菌屬）、Ruminococcus（瘤胃球菌屬）。兼性厭氧菌的構成上，單純性闌尾炎具有Klebsiella（克雷伯菌屬），化膿性闌尾炎具有Bulleidia（布雷德菌屬）、Streptococcus（鏈球菌屬），圖5。

圖3 LEfSe 分析進化分枝圖Fig.3 LEfSe analysis diagram of the structural difference

圖4 科水平組間差異Fig.4 Differences between groups at the family level

圖5 屬水平組間差異Fig.5 Differences between groups at the genus level

3 討論

兒童急性闌尾炎約占小兒外科急性腹痛的20%～30%，臨床上多認為其病因為糞便殘渣或淋巴組織增生阻塞闌尾管腔，導致管腔內高壓力，損害黏膜的完整性，進而導致感染并最終發(fā)生急性闌尾炎［5-6］。隨著分子生物學技術的發(fā)展，一些使用這些技術在闌尾炎領域的研究認為闌尾炎的發(fā)生與原發(fā)性感染相關［7-9］。高通量測序技術目前已廣泛用于腸道微生態(tài)研究，其中16S rRNA 測序方法可通過提取樣本中編碼細菌16S 核糖體基因的核酸序列，根據特定引物擴增該基因可變區(qū)序列，然后根據測序和數據庫比對進而了解樣本中細菌種類、豐度、差異性和多樣性［9］。這就彌補了傳統(tǒng)病原學培養(yǎng)低檢出率的不足，對探討闌尾炎的發(fā)病機制以及個性化治療具有指導意義［10-12］。

本研究采用16S rRNA 基因測序測定兒童急性闌尾炎手術患者闌尾腔分泌物，結果顯示，在屬水平菌落組成占總菌落50%的菌群中，發(fā)現單純性闌尾炎闌尾內容物中菌屬主要有Bacteroides（擬桿菌屬）、Faecalibacterium、Prevotella（普雷沃菌屬）、Agathobacter、Akkermansia（艾克曼菌屬）、Fusobacterium、Comamonas（單胞菌屬）、Parabacteroides（副擬桿菌屬）。化膿性闌尾炎內容物中菌屬主要有Fusobacterium、Bacteroides、Porphyromonas（卟啉 菌屬）、Escherichia_Shigella（埃希菌屬-志賀菌屬），兩組優(yōu)勢菌群均為G-厭氧菌，單純性闌尾炎組的闌尾內容物中益生菌比例高，而化膿性闌尾炎組中條件致病菌比例更高。THE 等［13］在對兒童闌尾標本的研究中發(fā)現，闌尾炎患者的闌尾組織中Fuso-bacteriaceae的豐度增加，它的增加也與闌尾炎的嚴重程度有關。本研究標本采集自闌尾內容物，得出的結論與其一致，在化膿性闌尾炎組Fusobacteriaceae豐度更高，Faecalibacterium、Agathobacter在單純性闌尾炎組具有更高的豐度，且差異有統(tǒng)計學意義。Faecalibacterium、Agathobacter這兩類菌屬可通過產生短鏈脂肪酸保護腸道黏膜屏障，Faecalibacterium中的普拉梭菌是具有抗炎作用的下一代益生菌［14-16］。厭氧菌組中單純性闌尾炎患者具有高豐度的Blautia，該菌同樣具有產生短鏈脂肪酸的能力，起到保護腸道黏膜降低人體炎癥水平的作用［17］。這些細菌豐度的差異或可用來解釋單純性闌尾炎患者感染指標改變不明顯以及鏡下病理局限于黏膜或黏膜下層的原因。Bilophila 在化膿性闌尾炎組存在顯著差異，該菌目前被認為與腸道屏障更高的滲透性和對感染和結腸癌更高的易感性相關，在闌尾炎中可作為病原菌［18-19］。這與化膿性闌尾炎患者感染指標明顯的升高以及鏡下炎性病變向肌層及漿膜層擴延的表現呈現一致性。Faecalibacterium、Agathobacter、Bilophila在兩組別間的差異有統(tǒng)計學意義，提示該細菌在不同病理類型的闌尾炎中可能存在特殊的臨床意義，為闌尾炎的發(fā)病機制研究增加理論支持。有益菌豐度減少可能會導致患者腸道正常生理功能受損，這提示腸道微生態(tài)制劑或糞菌移植或許對闌尾炎的治療有所幫助，為保守治療闌尾炎提供個體化治療的新的方向。

日常病原學培養(yǎng)檢出率高的大腸埃希菌是腸桿菌科埃希菌屬細菌，屬兼性厭氧菌［20-21］。通過測序發(fā)現，埃希菌屬在單純性闌尾炎組豐度為（0.02±0.02），化膿性闌尾炎組為（0.08±0.12），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.42），且在菌群構成比例中排名第九位，不是闌尾內容物中的優(yōu)勢菌群。Bacteroides 在兩組樣本中均有較高豐度，雖差異無統(tǒng)計學意義（P=0.82），但單純性闌尾炎組（0.15±0.05）的豐度高于化膿性闌尾炎組（0.12±0.05）。劉枘岢等［22］的研究發(fā)現2 型糖尿病患者腸道菌群中Bacteroides 的豐度顯著下降。朱萬英等［23］發(fā)現肥胖兒童群體腸道中Bacteroides的多樣性及相似性降低。由此可見，Bacteroides參與人體腸道中許多重要的代謝活動，其豐度的平衡對人體健康有著重要的意義。有研究［24］表明抗感染藥物對腸道菌群的多樣性、結構組成和代謝功能等產生影響。在抗菌藥物的抗性基因傳播中，參與水平轉移的菌種以Bacteroides為主［25］。本研究發(fā)現化膿性闌尾炎組Bacteroides豐度降低，而臨床闌尾炎抗感染治療方案常規(guī)覆蓋厭氧菌，這可能加劇Bacteroides豐度的下降，提示在闌尾炎抗感染治療中常規(guī)覆蓋厭氧菌的方案是否必要值得思考。對于保守治療闌尾炎的患者，Bacteroides對抗菌藥物抗性基因的傳播也需更加關注。

本研究為單中心研究，存在以下不足：（1）例數較少，患者性別、民族、飲食結構和生活習慣均可造成菌群差異。（2）缺少正常闌尾內容物作對照。后期將增加樣本量，并納入健康對照人群，通過對比正常闌尾內容物，進一步探索闌尾內容物菌群的構成差異。（3）在本研究中，不能回答闌尾炎中糞體的存在和微生物群之間的潛在相關性，這是未來研究的關注點。（4）本研究的一個局限性是使用了預防性抗生素。抗生素的有益作用已被廣泛接受，由于它們只在手術前很短的時間內使用，認為抗生素的使用并不能解釋研究發(fā)現的差異。（5）目前臨床治療方案常規(guī)覆蓋抗厭氧菌活性，闌尾炎中Bacteroides低豐度的表達，對目前的治療方案提出了挑戰(zhàn)，后期針對不同類型抗菌藥物對腸道菌群的影響展開深入研究，為從調整菌群平衡的角度開展闌尾炎的治療提供支持，從而達到個體化治療的目的。