一個兩次妊娠外生殖器畸形胎兒家系的臨床遺傳學分析

張亞南 席惠 方芳 賈政軍 龐佳倫 鄺海燕 張巍 彭瑩

1湖南省婦幼保健院（長沙 410008）；2廣州嘉檢醫學檢測有限公司（廣州 510300）

中國是出生缺陷高發的國家之一，其中先天性外生殖器畸形是一類病因復雜種類繁多的疾病，因其涉及生殖系統的結構和功能，對個人及家庭的影響較其他系統畸形可能更為嚴重［1］。因此，盡早在產前發現胎兒外生殖器發育畸形及其他相關疾病，明確病因，對準確評估其預后有著重要的臨床意義。隨著產前超聲診斷技術的不斷發展，胎兒泌尿系統畸形檢出率不斷提高，但由于胎兒外生殖器異常病因復雜，很少能在產前得到明確致病原因［2］，這也給產前診斷帶了新的挑戰。

外生殖器的發育因環境、遺傳、內分泌等因素使其在胚胎分化時期出現異常分化，表現出不同類型及不同程度的外生殖器畸形［3］。其中以先天性腎上腺皮質增生（congenital adrenal hyperplasia，CAH）、雄激素不敏感綜合征和性染色體異常引發的畸形最多見［4-5］。CAH 是一種常染色體隱性遺傳病，其中以位于6p21.33 的CYP21A2 基因缺陷引起的21-羥化酶缺乏癥（21-hydmxylase deficiency，21-OHD）是最常見的類型［6］，CYP21A2 基因編碼21 羥化酶，參與腎上腺激素代謝過程［7-8］。21-OHD會引起皮質醇、醛固酮合成不足，女性男性化、男性性早熟，甚至出現腎上腺危象［9-10］。目前21-OHD患者使用的糖皮質激素療法可能會導致非生理劑量，對健康產生負面后果，患有21-OHD 的女性其生育能力似乎受到了損害［11］，尤其是失鹽型女患者，發生妊娠糖尿病和剖宮產的風險更高［12］。長效糖皮質激素可能不太有利，尤其是地塞米松［12］。因此，早確診對預防出生缺陷具有重要意義。

本研究通過聯合運用多項產前診斷技術，快速準確尋找一個兩次妊娠外生殖器畸形胎兒家系的遺傳病因，為該家系的遺傳咨詢和產前診斷提供了重要參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，35 歲，G2P0。G1 于2017年因27 周超聲提示胎兒外生殖器異常引產，引產胎兒診斷為外生殖器畸形（未做遺傳學檢測）。本次自然受孕，早孕期無陰道流血，早孕期無感冒等疾病史，無不良因素接觸史，本人及家屬否認近親婚配。孕期產檢無特殊，未行NT 檢測，未行唐氏篩查，NIPT 檢測陰性。24 周超聲提示胎兒外生殖器異常聲像；27 周再次行超聲檢查，提示胎兒外生殖聲像失去正常形態，雙側類似于類陰囊聲像不典型。經孕婦知情同意后于28 周行引產前臍血染色體核型分析，尸體解剖和病理檢查、基因檢測等檢查。

1.2 研究方法

1.2.1 臍血染色體核型分析 在超聲定位下抽取適量臍帶血肝素鈉抗凝，按照臍血染色體制備方法進行細胞培養、收獲及制片，G 顯帶，核型分析。常規計數20 個分裂象，分析5 個核型，異常核型時加大計數。根據人類遺傳學國際命名體制（ISCN 2020）標準對染色體核型進行命名。

1.2.2 超聲學檢查 應用GEVoluson E8 彩色多普勒超聲診斷儀對胎兒進行系統超聲檢查，并針對胎兒泌尿生殖器進行詳細檢查。

1.2.3 尸體解剖 對引產胎兒進行泌尿生殖器器官解剖。

1.2.4 CYP21A2基因檢測 采用DNA 提取試劑盒（QIAmp DNA Blood Mini kit，QIAGEN，德國）提取組織/外周血基因組DNA，進行CYP21A2 真基因長片段擴增，排除假基因CYP21A1P 同源序列（同源性高達98%）的干擾，然后將擴增產物進行捕獲測序，平均測序深度約為1 000 ×，參考基因組為CYP21A2（NM_000500，hg19）堿基序列，檢測點突變和小片段缺失重復。CYP21A2 基因若大片段缺失后會發生基因重組，此時會擴增出一個融合基因的RCCX 模塊（RCCX module，RP-C4-CYP21-TNX，包括CYP21A1P 的3 端、所有的C4B 和CYP21A2 的5 端，約30 kb，圖1），該模塊有3 個酶切位點，此時將CYP21A2 基因長片段擴增產物進行限制性內切酶片段長度多態性分析，檢測胎兒組織及胎兒父母CYP21A2 基因30 kb 大片段缺失情況和驗證變異來源。若酶切后的電泳圖譜只出現3.7/2.5 kb 條帶，則沒有30 kb 大片段缺失；若檢測到主要條帶為3.2/2.5 kb，則存在大片段純合缺失；若酶切圖譜中有3.7/2.5 kb 條帶和3.2/2.4 kb 條帶，則存在大片段雜合缺失。樣本外送廣州嘉檢醫學檢測有限公司檢測。本研究經過醫院倫理委員會批準（編號：2020-S085）。該病例的樣品采集和遺傳學研究獲得患者知情同意。

圖1 典型的RCCX 模塊基因示意圖Fig.1 A schematic representation of the typical RCCX module genes

2 結果

2.1 臍血染色體核型分析結果 胎兒臍血染色體核型為46，XX，inv（9）（p11.2q13）（圖2），其父母拒絕行外周血染色體核型對照檢查。

圖2 染色體核型圖Fig.2 The karyotype of fetal cord blood cells

2.2 超聲學檢查 G1（2017年第一次妊娠）：27 周超聲提示：胎兒外生殖器失去正常聲像，未見正常的類陰囊聲像，中間可見1.46 cm 長的高回聲類陰莖聲影，前端朝下，外側見類大陰唇聲像（圖3A）。

G2（本研究中即第二次妊娠）：24 周超聲提示：外生殖聲像失去正常形態，雙側類似于類陰囊聲像，不典型，中間可見0.9 cm 長的高回聲類陰莖聲影，末端較扁，朝向肛門方向（圖3B）。27 周超聲提示：胎兒外生殖聲像失去正常形態，雙側類似于類陰囊，聲像不典型，末端較扁，朝向肛門方向（圖3C）。27 周四維超聲提示腎上腺增大（圖3D）。

圖3 兩次妊娠孕晚期胎兒外生殖器聲像圖Fig.3 Ultrasonography of the genitalia in the third trimester of two pregnancies

2.3 尸體解剖 外生殖器異常（圖4A），腎上腺增大（圖4B），胎兒其他器官未見其他明顯異常。腎上腺病理檢查提示胎兒腎上腺皮質微囊性增生（圖4C）。

圖4 胎兒尸體解剖和病檢結果Fig.4 Autopsy and medical examination of the fetus

2.4 CYP21A2 基因檢測 根據上述生理和病理檢測結果，臨床上考慮先天性腎上腺皮質增生，因此對胎兒及其父母進行CYP21A2 基因檢測。CYP21A2 基因擴增產物經限制性內切酶片段長度多態性分析，結果提示引產胎兒存在30 kb 大片段純合缺失，其父母均為攜帶者（圖5）。CYP21A2 基因經長片段PCR 擴增后進行二代測序，檢測到11個純合變異，分別為c.92C > T（p.P31L），c.293-13C > G，c.332_339del8（p.G111Vfs*21），c.518T >A（p.I173N），c.710T > A（p.I237N），c.713T > A（p.V238E），c.719T > A（p.M240K），c.844G > T（p.V282L），c.923dupT（p.L308Ffs*6）、c.955C > T（p.Q319*）和c.1069C > T（p.R357W），這些變異遺傳自胎兒的父親和母親，提示CYP21A2 基因30 kb純合缺失形成了CYP21A1P/CYP21A2 嵌合基因，從而導致CYP21A2 基因失活。CYP21A1P/CYP21A2融合基因具體9 種分型依據［13］，本例胎兒攜帶大片段純合缺失，存在p.P31L、c.293-13C > G、c.332_339del8、p.I173N、p.Q319*和p.R357W 變異，因此CYP21A1P/CYP21A2 融合基因類型是CH-8 型。

圖5 CYP21A2 基因長片段擴增產物進行限制性內切酶片段長度多態性檢測Fig.5 Restriction endonuclease fragment length polymorphism was detected by long fragment amplification products of CYP21A2 gene

3 討論

本研究中該家系兩次妊娠，均在孕中期超聲檢查發現胎兒外生殖器異常，最終均選擇了引產。首先通過臍血染色體核型分析，確定胎兒染色體為46，XX，inv（9）（p11q13）；同時超聲檢查提示胎兒外生殖器畸形和腎上腺增大，尸檢結果與超聲檢查一致。鑒于以上結果顯示生殖器和腎上腺異常，臨床上考慮引產胎兒患有21-羥化酶缺乏癥，于是獲得家屬知情同意后進行基因測序，最終診斷胎兒為CAH 患者。21-羥化酶缺乏會導致皮質醇和醛固酮合成異常，促腎上腺皮質激素代償性分泌增加，引起腎上腺皮質增生及雄激素合成增多。21-OHD 主要因CYP21A2 基因大片段缺失和基因轉換引起［14］，目前已經報道與21-OHD 有關的突變有1 300 多種，不同的基因突變導致不同程度21-羥化酶活性下降，引起21-OHD 不同臨床表型［15-17］，也是引起女性胎兒外生殖器男性化畸形最常見的原因。46，XX 胎兒在胚胎時期由于腎上腺源性雄激素過多，其外生殖器在胚胎6～8 周出現男性化改變，如陰蒂增大、陰唇融合、尿生殖竇形成［8，18］。

隨著遺傳學技術的快速發展，全外顯子測序因檢測深度大，范圍廣等優勢已廣泛運用在臨床罕見病、疑難病中。但對于本研究所涉及的21-OHD 而言，由于其致病基因CYP21A2 存在一個與其基因序列高度同源的假基因（CYP21A1P），其外顯子和內含子的同源性分別高達98%和95%，且主要致病突變是真假基因間的高頻率的基因轉換和重排導致［7，19］，故全外顯子測序對于該病的檢測并不適用，目前常用的檢測方法是Sanger 測序聯合多重連接探針擴增（MLPA）［6，20］、設計序列特異性引物進行CYP21A2 基因擴增聯合下一代測序（NGS）進行測序［21］等方法將基因點突變、大片段缺失和重復同時檢出，避免漏診。

本文在對引產胎兒及其父母進行CYP21A2 基因突變檢測和分析中，采用限制性內切酶片段長度多態性分析，發現胎兒存在一個30 kb 大片段純合缺失變異，其父母均為非近親的攜帶者；同時設計引物將CYP21A2 真基因長片段擴增，檢測到胎兒存在11 個純合變異，分別為c.92C>T（p.P31L），c.293-13C > G，c.332_339del8（p.G111Vfs*21），c.518T>A（p.I173N），c.710T>A（p.I237N），c.713T >A（p.V238E），c.719T > A（p.M240K），c.844G > T（p.V282L），c.923dupT（p.L308Ffs*6）、c.955C > T（p.Q319*）和c.1069C>T（p.R357W），這些變異遺傳自胎兒的父親和母親。因此，發現該胎兒CYP21A2基因存在11 個純合變異是由30 kb 純合缺失相關的同源基因重組引起，且這些突變均能造成不同程度21-羥化酶活性下降，從而導致CYP21A2 基因失活。研究表明，CYP21A2 基因大片段缺失的突變類型占20%［22］，缺失范圍為從CYP21A1P 假基因3'端到CYP21A2 基因5'端，大部分突變遺傳自父母，可導致21-羥化酶活性完全喪失，是21-OHD最常見的致病基因突變之一。本研究引產胎兒還攜帶致病性最強的變異p.（V282L）［20］。CYP21A2不同的基因突變造成不同程度21-羥化酶活性下降，引起不同的臨床表型［23］，其中典型2l-OHD 女童的男性化程度與CYP21A2 基因變異導致的酶活性喪失程度呈正相關［24］。本研究胎兒在孕期就出現明顯的外生殖器異常，是因為CYP21A2 基因30 kb 大片段純合缺失造成真假基因融合，產生融合基因CH-8 型，嚴重損害蛋白質的結構和功能，造成21-羥化酶的酶活性極度缺乏或完全喪失［14］，導致胎兒皮質激素合成不足，增大促腎上腺素分泌，大量皮質醇前體產物堆積并向雄性激素轉化，最后表現出腎上腺增大和外生殖器異常，胎兒出生后還可能會出現腎上腺危象、休克和后遺癥。

本研究通過對一個兩次妊娠外生殖器畸形胎兒家系先后聯合運用臍血染色體核型分析、產前超聲檢查以及尸體解剖驗證，層層遞進，環環相扣，有針對性的選擇了CYP21A2 基因檢測方案。最終發現胎兒攜帶的CYP21A2 基因突變是21-羥化酶缺乏癥的致病原因，從而明確該家系兩次妊娠外生殖器畸形胎兒的遺傳病因，為其遺傳咨詢和產前診斷提供了重要依據，對降低出生缺陷、優生優育有重要指導意義。本研究也存在不足之處，由于基因檢測只針對CYP21A2 基因，胎兒期表型觀察有限，不排除本報道高齡產婦攜帶其他基因致病突變，建議夫妻生育前進行攜帶者篩查。