基于Akt/mTOR通路觀察補中益氣顆粒對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的保護作用

姚 婷，萬 明

(成都醫學院第二附屬醫院 核工業四一六醫院，四川 成都 610051)

自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)包括產后甲狀腺炎、慢性淋巴性甲狀腺炎等，是一種自身免疫性疾病，潛伏期較長，具有器官特異性，其發病率約為1%～2%，多發于中年、女性人群中，近年來發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。AIT是一種由T淋巴細胞介導的常見自身免疫性疾病，主要病理表現為甲狀腺功能減退，可能導致妊娠患者早產甚至流產，隨著病情的發展，還可能增加甲狀腺癌的發生風險，嚴重影響患者的生命健康。AIT的病因復雜，目前關于AIT的發病機制尚未完全闡明，學界普遍認為遺傳因素、環境因素、免疫功能紊亂均是導致AIT發生的重要原因[3]。目前治療AIT的方法主要包括免疫療法、激素替代療法、手術治療等，均存在一定的弊端，且療效不理想，多存在不良反應明顯、復發率較高等問題，即使能夠改善甲減病情，但無明顯的免疫調節作用[4]。因此，尋找不良反應少、安全性高、臨床療效顯著的AIT治療方法是目前臨床上亟待解決的問題。中醫療法在AIT的治療中取得了滿意的療效[5]。研究表明，補中益氣顆粒能夠明顯改善AIT模型大鼠的甲狀腺功能，療效顯著[6]。但關于補中益氣顆粒治療AIT的作用機制尚未完全闡明，蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)/雷帕霉素靶向基因(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路參與細胞的自噬和凋亡過程，是細胞內重要的信號轉導途徑之一，Akt/mTOR信號通路的活化影響ULK1/2、Atg13等蛋白的表達，從而發揮對細胞自噬的抑制作用。研究表明，AIT的發生發展與Akt/mTOR通路的活化抑制甲狀腺組織中細胞自噬水平密切相關。本研究旨在通過Akt/mTOR通路揭示其對實驗性自身免疫性甲狀腺炎(Experimental autoimmune thyroiditis,EAT)大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD雌性大鼠共40只，8周齡，體重120～140 g，由北京維通利華公司提供，動物合格證號：SYXK(京)2018-0042，于符合GB14925-2010標準的環境下適應性喂養1周，自由攝食飲水。

1.1.2 藥品與主要試劑：補中益氣顆粒(國藥準字Z20040120)，成分包括炙黃芪、炙甘草、黨參、陳皮、當歸、柴胡、升麻、大棗、炒白術、生姜；豬甲狀腺球蛋白(pTg，武漢純度生物科技有限公司)；完全弗氏佐劑(CFA，德國默克公司)；游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)采用酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物)檢測；γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體(圣克魯斯生物技術有限公司)；總蛋白提取試劑盒(上海恒遠生物)；Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗體(美國abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及EAT模型建立：將40只大鼠隨機分為空白組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組10只。采用pTg和CFA混合免疫注射聯合高碘喂養法制備EAT大鼠模型[7]，除空白組外，其余各組大鼠從第2周開始給予初次免疫：PBS緩沖液將pTg溶解呈1 mg/ml溶液，與CFA充分混合乳化(CFA抗原乳劑)，取0.2 ml注射于大鼠足墊部皮下；第4周開始注射CFA抗原乳劑0.2 ml加強免疫，1次/周，至第10周結束，空白組大鼠注射等體積的PBS緩沖液；實驗結束后，ELISA法測定大鼠血清中TPOAb、TGAb和TSH水平對模型進行評價，TPOAb、TGAb和TSH水平較空白組明顯升高為模型建立成功。

1.2.2 給藥：第10周后，低劑量組和高劑量組大鼠每天給予1.5 ml補中益氣湯灌胃，劑量分別為0.80、0.94 g/kg，空白組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，治療時間為2個月。

1.3 指標檢測

1.3.1 大鼠甲狀腺功能及抗體水平的測定：各組大鼠治療結束當天禁飲食12 h，經10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血5 ml，離心獲得血清，采用ELISA法測定FT3、FT4、T3、T4、TPOAb、TGAb和TSH水平。

1.3.2 大鼠甲狀腺組織病理HE染色觀察：取各組甲狀腺組織，固定、切片、二甲苯脫蠟、透明、水化、蘇木精染色、分化、返藍、伊紅染色、順濃度梯度乙醇脫水、干燥、封片，光學顯微鏡下(×200)觀察甲狀腺組織的實質和間質。

1.3.3 甲狀腺濾泡上皮細胞自噬小體超微結構的觀察：每組隨機選取1只大鼠，取單側1 mm×1 mm×1 mm大小的甲狀腺組織，戊二醛溶液固定，PBS洗滌、固定、脫水、包埋、切片、甲苯胺藍染色，光鏡下定位，切成100 nm超薄片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡下觀察自噬小體的超微結構。

1.3.4 免疫組化分析大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、IL-4、Caspase-3表達水平：切片、水化、抗原修復、封閉，加一抗4 ℃過夜孵育，37 ℃加二抗孵育，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。蘇木精復染，脫水，封片，光學顯微鏡下觀察。采用Image Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)圖像處理軟件檢測吸光度，分析IFN-γ、IL-4和Caspase-3的積分光密度(IOD)平均值。

1.3.5 Western blot檢測大鼠甲狀腺組織Akt/mTOR通路蛋白表達：取各組大鼠的甲狀腺組織，用無菌剪刀剪碎后加入裂解液，待組織裂解后采用離心法分離，離心條件為4 ℃，3000 r/min，10 min，用BCA試劑盒對上清液定量，SDS-PAGE分離總蛋白。然后轉膜，并用5%的脫脂牛奶密封。加一抗4 ℃過夜孵育，再與HRP偶聯的羊抗鼠IgG(1∶5000)在37 ℃孵育60 min，使用Quantity One軟件進行定量分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠甲狀腺抗體指標比較 見表1。EAT大鼠模型制備完成后，模型組大鼠血清TPOAb、TGAb、TSH水平明顯高于空白組(P<0.05)，說明造模成功。治療后，模型組大鼠上述血清甲狀腺抗體水平較空白組明顯升高(P<0.05)，低劑量組和高劑量組大鼠血清TPOAb、TGAb、TSH水平較模型組明顯降低，且高劑量組降低程度更明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠甲狀腺抗體指標比較(IU/ml)

2.2 各組大鼠甲狀腺功能比較 見表2。與空白組相比，模型組大鼠血清甲狀腺功能指標明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠血清甲狀腺功能指標均明顯下降(P<0.05)。

表2 各組大鼠甲狀腺功能比較

2.3 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺組織病理形態的影響 空白組大鼠甲狀腺組織未見炎性細胞浸潤，甲狀腺濾泡呈圓形或橢圓形，腔內充滿淡紅色膠質，且分布均勻，血管豐富，無纖維化病灶。模型組組織中存在大量浸潤的淋巴細胞，濾泡排列不均勻且大小各異，部分萎縮，濾泡腔內可見部分脫落上皮細胞，組織發生間質纖維化。低劑量組和高劑量組組織中散在淋巴細胞分布，纖維組織增生，濾泡腔內充滿分布均勻的淡紅色膠質，濾泡呈圓形或橢圓形(圖1)。

2.4 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞自噬小體的影響 見圖2。模型組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞中自噬小體數量(6.37±1.87)個，較空白組(18.26±2.95)個明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組(14.25±2.73)個和高劑量組(12.47±2.24)個自噬小體數量明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。

A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組

2.5 各組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4值比較 見表3。甲狀腺組織中免疫陽性物呈棕色，IFN-γ主要表達于甲狀腺上皮細胞的細胞核中，IL-4主要表達于甲狀腺濾泡腔內。四組大鼠甲狀腺組織中IL-4的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。與空白組相比，模型組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ表達水平、IFN-γ/IL-4值明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ表達水平、IFN-γ/IL-4值明顯下降(P<0.05)。

表3 各組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4值比較

2.6 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺組織中Caspase-3表達的影響 見圖3。 與空白組(0.003±0.001)相比，模型組大鼠甲狀腺組織中Caspase-3蛋白的IOD值(0.007±0.001)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組(0.005±0.002)和高劑量組(0.004±0.001)大鼠Caspase-3蛋白的IOD值明顯下降(P<0.05)。

A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組

2.7 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺組織Akt/mTOR通路蛋白表達的影響 四組大鼠甲狀腺組織中Akt、mTOR蛋白表達比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與空白組相比，模型組大鼠甲狀腺組織中p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠甲狀腺組織中p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4(表4)。

圖4 Western blot分析各組甲狀腺組織中

表4 各組大鼠甲狀腺組織中Akt/mTOR通路蛋白相對表達水平的比較

3 討 論

AIT是一種由T淋巴細胞介導的常見自身免疫性疾病，主要表現為甲狀腺功能減退，可能導致妊娠患者早產甚至流產，隨著病情的發展，還可能增加甲狀腺癌的發生風險，嚴重影響患者的生命健康[8-10]。目前治療AIT的方法主要包括免疫療法、激素替代療法、手術治療等，均存在一定的弊端，且療效并不理想[11]。脾是重要的免疫器官，而免疫功能的調節是治療AIT的重要措施[12]。研究表明，AIT引起血清TPOAb、TGAb水平升高，甲狀腺組織病理結構改變、抑制甲狀腺功能等，這些指標的變化都反映了甲狀腺組織的損傷程度[13]。補中益氣顆粒常用于治療脾虛下陷等證。本研究中，經補中益氣顆粒治療后EAT大鼠毛發漸顯光澤，活動量增多，攝食量逐漸改善，體重逐漸恢復，精神狀態良好。在觀察期間，補中益氣顆粒治療后大鼠甲狀腺抗體指標TPOAb、TGAb、TSH、甲狀腺功能指標FT3、FT4、T3、T4明顯下降，甲狀腺組織病理形態明顯改善，表明補中益氣顆粒對EAT大鼠有較好的治療作用。有研究結果顯示，補中益氣顆粒能夠明顯改善AIT模型大鼠的甲狀腺功能，但具體作用機制尚未完全闡明[6]。因此，本研究探討補中益氣顆粒對EAT大鼠的保護作用機制。

Akt/mTOR信號通路參與細胞的自噬和凋亡過程，是細胞內重要的信號轉導途徑之一，Akt/mTOR信號通路的活化影響ULK1/2、Atg13等蛋白的表達，從而發揮對細胞自噬的抑制作用[14-15]。研究表明，AIT的發生發展與Akt/mTOR通路的活化抑制甲狀腺組織中細胞自噬水平密切相關[16]。阻斷Akt/mTOR通路已成為治療AIT的新思路。細胞凋亡水平的異常也參與了甲狀腺濾泡的損傷。Caspase-3在細胞凋亡中發揮著重要的作用，其蛋白表達變化反映甲狀腺組織中細胞的凋亡水平[17]。本研究發現，模型組較空白組的甲狀腺組織中Caspase-3、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量明顯增加，自噬小體數量明顯減少，表明AIT的發生與細胞自噬、凋亡和Akt/mTOR信號通路的活化有關。補中益氣顆粒治療后，Caspase-3、p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯下降，自噬小體數量明顯增加，表明補中益氣顆粒能夠作用于Akt/mTOR通路，調節甲狀腺組織細胞自噬和凋亡水平，從而起到治療的作用。

研究表明，Akt/mTOR通路的激活與炎性細胞的浸潤和炎癥反應相關[18]。Th1和Th2細胞平衡的失調是導致AIT發病的主要原因，T淋巴細胞和特異性細胞因子在AIT的發生發展中起到了關鍵的作用[19]。當受到遺傳或環境因素的影響使甲狀腺組織出現T淋巴細胞浸潤，造成甲狀腺組織的破壞，誘導炎癥反應的發生，從而導致Th1和Th2細胞平衡的失調，放大了甲狀腺的自身免疫反應[20]。IFN-γ是Th1型細胞因子，IL-4是Th2型細胞因子，均是反映Th1/Th2細胞免疫應答強度的指標。張秋娥等[16]研究結果顯示，鄰苯二甲酸二異壬酯處理可通過激活Akt/mTOR信號通路，使AIT模型大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、p-Akt、p-mTOR表達水平升高，IFN-γ/IL-4值明顯增加，加重AIT大鼠的癥狀。本研究中，模型組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ的表達水平較空白組明顯升高，IFN-γ/IL-4值明顯增加，表明Th1/Th2細胞平衡的失調參與了AIT的發生，Th1型淋巴細胞占主導地位。補中益氣顆粒治療后，低劑量組和高劑量組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ表達水平明顯下降，IFN-γ/IL-4值明顯減小，Th1/Th2細胞平衡逐漸恢復，表明補中益氣顆?？赡芡ㄟ^降低Th1型細胞因子表達水平，恢復Th1/Th2平衡，發揮EAT大鼠的保護作用。

綜上所述，補中益氣顆粒對EAT大鼠具有保護作用，可有效改善大鼠的自身抗體水平和甲狀腺功能，恢復甲狀腺組織病理形態，降低甲狀腺組織中IFN-γ/IL-4值和Caspase-3表達水平，調節細胞凋亡和自噬，其機制可能與抑制Akt/mTOR通路的活化有關。