桑玉膏對對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷保護作用研究

李悅寧，肖柯心，趙冰潔，李紅玉，王 番，詹 博，賈艷艷

(1.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069；2.空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，陜西 西安 710032；3.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046)

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury，DILI)是指人體在用藥期間由于藥物本身或其代謝產物所引起的肝功能異常，大多數是由各種原因引起體內CYP450酶活性降低或失活導致藥物在體內蓄積所誘導的肝臟損傷[1-3]。據相關流行病學調查顯示，近年來DILI作為常見的藥物不良反應之一，占歐美急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)病例的7%～15%[4]，而在我國普通人群中的年發病率略高于西方國家并呈現逐年增高趨勢[5-7]。此外，在引起DILI的藥物中，部分營養膳食補充劑、抗結核藥物、非甾體解熱鎮痛藥、抗腫瘤藥物、激素類藥物等排名靠前[8]。對乙酰氨基酚(APAP)作為臨床中常用的解熱鎮痛藥物，目前已成為全球，尤其歐美等部分發達國家導致急性肝衰竭的首要病因，占ALF病例的50%左右[9]，嚴重影響人們的正常生活。近年來對DILI的治療一般采取抗炎抗氧化的保肝治療以及免疫調節治療等， N-乙酰半胱氨酸(NAC)是目前治療APAP所致藥物性肝損傷的首選藥物[10]，但又因其本身不可避免的不良反應，尋求新的治療藥物仍迫在眉睫。

桑玉膏是空軍軍醫大學第一附屬醫院的中藥協定處方，主要選取玉竹、桑葚、黃精、薏苡仁、酸棗仁、枳椇子、梔子七味生藥，諸藥合用可補益肝腎，健脾益氣，除煩安神，改善肝炎等各種臨床癥狀或體征，具有疏肝保肝之功效。其中玉竹為君藥，具有養陰潤燥，生津止渴，清肝明目的作用；黃精補氣養陰潤肺，健脾益腎；桑葚、黃精、薏苡仁三藥合用能健脾益氣，兼補益肝腎，為臣藥；酸棗仁、枳椇子、梔子等共起養心安神，清肝除煩的作用，為佐使藥。臨床上顯示，桑玉膏可調節因肝火旺盛引起的易怒易躁、失眠多夢等，同時也可改善因不同原因引起的各類肝臟炎癥狀態，但具體作用機制尚不清楚。因此，本實驗選用APAP誘導的藥物性肝損傷小鼠模型，研究桑玉膏對小鼠肝臟的保護作用及作用機制，以期為其臨床治療肝病提供現代藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取60只健康雄性昆明種小鼠，SPF級，體重18～20 g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(陜)2019-001]。本實驗已獲空軍軍醫大學醫學倫理委員會審核通過，實驗期間均遵守實驗動物中心的各項管理規范要求和使用原則。

1.1.2 藥品與試劑：桑玉膏由空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科提供(批號20220312)；N-(4-羥基苯基)乙酰胺(對乙酰氨基酚，APAP)(批號20220211)；NAC(批號20220110)購自于碧云天生物技術公司，谷草轉氨酶(AST)測試盒(批號20220511)、谷丙轉氨酶(ALT)測試盒(批號20220511)、堿性磷酸酶(ALP)酶測試盒(批號20220511)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(批號20220325)、丙二醛(MDA)測試盒(批號20220325)、一氧化氮(NO)測試盒(批號20220611)等均采購于南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純。

1.1.3 實驗儀器：Spectra Max Pius3連續光譜掃描式酶標儀(香港分子儀器公司)；5810R大型高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司)、Milli-Q 純水儀(Millipore公司)、實時熒光定量(RT-PCR)儀器(Stepone plus，Applied Bio-systems)、KS 3000 ic control恒溫搖床(德國IKA公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥液制備：桑玉膏按人體劑量換算為小鼠劑量(小鼠劑量為人體劑量的9.01倍)，采用無菌PBS溶解，分別配制成濃度為45.05、90.10、180.20 mg/ml的低、中、高劑量溶液用于小鼠灌胃；NAC采用無菌PBS溶解，配制成濃度為20 mg/ml溶液用于小鼠灌胃；APAP采用無菌PBS溶解，配制成15 mg/ml溶液用于小鼠腹腔注射。

1.2.2 動物分組及造模給藥:健康雄性昆明種小鼠60只，5～7周齡，SPF 級，體重 18～20 g。飼養環境為晝夜時間1∶1交替循環，保持室內濕度45%～65%，室溫(22±3)℃，所有小鼠自由活動，均提供正常飲食飲水，適應性喂養7 d后隨機分為空白對照組、APAP模型組、NAC陽性藥物組和桑玉膏低、中、高劑量組(225、450、900 mg/kg)每組10只。造模前所有小鼠均禁食不禁水飼養12 h，空白對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其余各組按不同體重腹腔注射相應體積的APAP溶液(265 mg/kg)，測定AST和ALT的活性，與空白對照組比較，兩者升高則判定造模成功[11]。APAP模型制備完成后，各組小鼠均進行治療性給藥，每天給藥1次，灌胃體積為10 ml/kg，空白對照組和APAP模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，NAC組灌胃等體積的NAC溶液(200 mg/kg)，桑玉膏低、中、高劑量組分別灌胃桑玉膏225、450、900 mg/kg，連續給藥5 d，末次給藥后禁食不禁水12 h，腹腔主動脈取血，4 ℃ 3500 r/min離心15 min后收集血清，并解剖分離肝臟，檢測各項生化指標。

1.2.3 小鼠肝功能檢測：小鼠腹腔主動脈取血，血液置于1.5 ml EP管中并在室溫條件下靜置1 h，4 ℃ 3500 r/min離心15 min，分離血清，采用AST、ALT、ALP測定試劑盒檢測AST、ALT、ALP水平。

1.2.4 其他各項生化指標測定：4 ℃ 3500 r/min離心15 min，分離血清，使用ELISA法檢測血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、重組人白細胞介素-1β (IL-1β)水平含量；迅速分離肝臟，用PBS清洗掉表面浮血等雜質后，計算肝臟指數。肝臟指數=(肝臟重量/體重)×100%，按測定試劑盒說明書要求取部分新鮮肝臟用0.9%氯化鈉溶液制備肝組織勻漿，離心得肝勻漿上清液檢測SOD、MDA、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性及NO含量。

1.2.5 qRT-PCR 法檢測小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2的表達：采用TRIzol試劑盒從研磨后的冷凍小鼠肝臟組織中提取總RNA后按照相關cDNA合成試劑盒說明合成cDNA，接著對cDNA進行PCR擴增反應。引物設計由南京金斯瑞科技有限公司完成，見表1。所得數據采用2-△△Ct法進行統計分析。

1.2.6 肝組織病理學觀察：摘取小鼠右下葉少許肝臟組織固定在10%甲醛溶液中，24 h后用石蠟包埋制作病理切片，采取HE染色并在光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理學變化。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，采用單因素方差分析(ANOVA)進行組間比較;P<0.05表示差異具有統計學意義。

表1 基因擴增引物信息

2 結 果

2.1 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠肝臟指數以及血清中AST、ALT及ALP活性的影響 見表2。與空白對照組比較，APAP模型組小鼠血清AST、ALT、ALP以及肝臟指數均明顯升高(P<0.01)。與APAP模型組比較，NAC陽性藥物組及桑玉膏低、中、高劑量組的AST、ALT、ALP活性和肝臟指數均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。

表2 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠肝臟指數及血清AST、ALT和ALP活性的影響

2.2 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠組織SOD、MDA、GSH-PX、NO的影響 見表3。與空白對照組比較，APAP模型組小鼠肝組織SOD、GSH-PX活性均顯著降低(P<0.01)，MDA活性和NO含量顯著升高(P<0.01)；與APAP模型組比較，NAC陽性藥物組及桑玉膏低、中、高劑量組SOD、GSH-PX活性均顯著升高(P<0.01)，MDA活性和NO含量均顯著降低(P<0.01)。

表3 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠SOD、MDA、GSH-PX、NO的影響

2.3 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-1β的影響 見表4。與空白對照組比較，APAP模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)；與APAP模型組比較，NAC陽性藥物組和桑玉膏低、中、高劑量組TNF-α和IL-1β含量均顯著降低(P<0.01)。

2.4 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響 見表5。與空白對照組比較，APAP模型組小鼠肝臟組織中Bax的mRNA表達顯著升高(P<0.01)，Bcl-2的mRNA表達顯著下降(P<0.01)；與APAP模型組比較，NAC陽性藥物組和桑玉膏低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中Bax的mRNA表達均顯著下降(P<0.01)，Bcl-2的mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。

表4 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-1β的影響(pg/ml)

2.5 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠肝組織病理學的影響 在顯微鏡下觀察，空白對照組小鼠肝細胞排列整齊，肝小葉結構清晰，形態結構正常；APAP模型組肝損傷小鼠肝細胞體積增大，可見到不同程度的點狀壞死灶和炎性細胞浸潤，同時匯管周圍細胞分界模糊，裂解嚴重。給予桑玉膏干預后，各組均能有效減輕肝細胞腫脹程度，點狀壞死灶面積減少，有效改善肝細胞損傷(圖1)。

表5 桑玉膏對APAP肝損傷小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

A：空白對照組；B：APAP模型組；C：NAC陽性藥物組；D：桑玉膏低劑量組；

3 討 論

中醫藥對DILI的治療歷史悠久，DILI的病位屬肝，多數皆因用藥不當后的藥物毒性所引起。歷代醫家普遍認為DILI與感受時邪、久病體虛等密切相關，而肝失疏泄是關鍵病機之一[12-14]。肝臟是人體最大的代謝器官，主疏泄，疏泄正常，則人體氣機通暢，脾胃運轉自如，面色紅潤，反之，則氣機不暢，脾失健運，氣血虧虛，形成瘀血，為脅痛。有研究表明， DILI一般分為劑量依賴性的直接藥物性肝損傷與特異質型藥物性肝損傷，直接藥物性肝損傷指在藥物使用后，其藥物本身或相關代謝產物對肝臟細胞造成的直接損傷，大多與藥物使用劑量有關[15-18]。APAP誘導的急性肝損傷屬直接藥物性肝損傷，免疫系統紊亂和細胞氧化應激是其主要機制之一[19-22]。臨床實踐證明，中醫藥具有不良反應小、性質溫和等優點，且部分中醫藥對DILI的治療效果顯著，在臨床上具有廣闊的應用前景。唐文誠等[23]建立小鼠APAP急性肝損傷模型，通過枳椇水提物4 d的灌胃治療發現，枳椇水提物單方可明顯改善APAP造成的肝臟損傷，但使用過久難免產生相應不良反應。桑玉膏作為一款藥食同源的中藥復方，含枳椇子、薏苡仁、桑葚等多種成分，其中不同組分以有效配伍的方式發揮作用，不簡單作用于機體某個確定的靶點。基于此，本實驗選用ALT、AST、ALP、MDA、NO、GSH-PX、促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2等指標以及肝組織病理學評價桑玉膏對APAP所致肝損傷的保護作用及相關作用機制。結果顯示，桑玉膏低、中、高劑量組均能不同程度緩解APAP導致的小鼠肝組織病理改變和炎癥狀態，同時桑玉膏各劑量組可顯著降低促凋亡蛋白Bax的表達，上調抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，且高劑量效果最為明顯，說明桑玉膏能有效緩解APAP引起的肝損傷。此研究發現APAP所致肝損傷能刺激小鼠體內TNF-α、IL-1β炎癥因子在細胞中表達增多，造成免疫系統紊亂，但經桑玉膏干預后，TNF-α、IL-1β的表達顯著減少，提示桑玉膏緩解APAP所致的肝損傷可能是通過減輕其炎癥反應來達到治療效果，與免疫反應相關信號通路密切相關。

綜上所述，桑玉膏可能通過提高機體抗氧化能力，加快體內活性氧的清除，同時抑制炎癥因子應答，減緩炎癥發生從而起到保護APAP模型小鼠肝臟的作用。