影響苯胺法檢測游離棉酚的因素分析研究

柴 燃，季紹東，史自強，吳 迪，宋偉光，高 偉

（1.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲 056250；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲市天然產物與功能性食品開發(fā)重點實驗室，河北邯鄲 056038；3.河北省植物資源綜合利用重點實驗室（籌），河北邯鄲 056107）

棉籽中含有大量油脂和豐富蛋白質，可用作食品和飼料中蛋白質、油脂的來源。我國棉籽年產量約1000萬t，居世界首位，若能充分利用可顯著降低我國糧食供應風險。但棉籽的色腺體中包含棉酚，占棉籽總重量的0.4%～2%（Cai等，2004）。盡管棉酚具有抗生育（Sharaky等，2010）、抗腫瘤（Zeng等，2019）等生物活性，但游離棉酚含量過高會影響哺乳動物（Zhu等，2020）和禽類（Farthing等，2019）的正常生理過程。棉酚的存在限制了棉籽相關產品在食品和飼料中的應用（Lv等，2010）。棉酚在棉籽產品中有兩種存在形式，分別是游離狀態(tài)的棉酚（FG）和結合狀態(tài)的棉酚（BG）。結合棉酚是通過棉酚上的醛基與蛋白質、氨基酸的游離氨基之間發(fā)生反應，形成共價化合物（Lu等，2017）。游離棉酚的活性醛基和活性羥基處于游離狀態(tài)（Khalaf等，2008），易與動物體內的蛋白質、氨基酸等發(fā)生反應，干擾正常生理過程，產生毒性。結合棉酚由于活性基團與其他物質結合（Pons等，1977），對動物的健康影響不大（Gadelha等，2014），因此在國家和行業(yè)標準中，棉籽蛋白、棉籽油和棉籽粕的關鍵性控制指標為游離棉酚的含量。

不同棉籽產品采用的檢測方法不同。棉籽油和植物性食品采用高效液相法檢測游離棉酚；當棉籽產品用作飼料時，采用苯胺法檢測游離棉酚；而脫酚棉籽蛋白這兩種方法均可。脫酚棉籽蛋白作為一種用于飼料的新型蛋白原料，與傳統(tǒng)棉籽加工而成的棉籽粕有著巨大區(qū)別。《脫酚棉籽蛋白》（GH/T1042-2007）行業(yè)標準明確了脫酚棉籽蛋白的質量指標：粗蛋白質含量大于50%，以分光光度計法測定的游離棉酚不得超過400 mg/kg、高效液相色譜（HPLC）法測定的游離棉酚不得超過60 mg/kg。高效液相色譜法檢測標準明顯要高于分光光度計法，但對分光光度計法和高效色譜法檢測結果差異的具體原因鮮見研究報道。分光光度計法分為苯胺法和間苯三酚法（Thatching等，2008）。我國飼料行業(yè)的最新標準《飼料中游離棉酚的檢測》（GB 13086-2020）和歐盟采用的是苯胺法，因此本研究中采用苯胺法檢測樣品中的棉酚含量，通過比較苯胺法和高效液相色譜法的結果差異，研究影響苯胺法檢測的因素，這對于棉酚的檢測研究和棉籽產品的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、恒溫水浴鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、紫外分光光度計（日本島津公司）、超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）、純水儀、振蕩器（常州國華電器有限公司）。

1.1.2 試劑和材料 正己烷、苯胺、異丙醇、冰乙酸、3-氨基-1-丙醇、丙酮、磷酸購自天津光復試劑，均為分析純；色譜純丙酮、乙醇、甲醇和棉酚標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米淀粉購自上海麥克林生化公司；棉籽油見自河北晨光生物科技集團。為保證苯胺的純度，在使用之前加入鋅粒進行蒸餾提純處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯胺法檢測棉酚 按照GB/T 13086-2020《飼料中游離棉酚的測定方法》規(guī)定的檢測步驟進行。溶劑A的配制：將異丙醇/正己烷（500 mL，6：4，V/V）混合溶劑、冰醋酸（8 mL）、純水（50 mL）和3-氨基-1-丙醇（2 mL）置于1 L的容量瓶中，再用異丙醇/正己烷混合溶劑補足。

1.2.2 高效液相色譜法檢測棉酚 參考GB 5009.148-2014《植物性食品中游離棉酚的測定方法》中規(guī)定的檢測步驟，萃取液采用乙醇或丙酮。液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），檢測波長：235 nm，柱溫：40℃，進樣量：10μL，流速：1.0 mL/min，流動相為0.5%磷酸水溶液：甲醇=15：85。

1.2.3 棉酚氧化物對棉酚檢測的影響 稱取0.1 g棉酚至燒杯中，加入9.9 g玉米淀粉，攪拌均勻，常壓下120℃烘干4 h，分別采用苯胺法和高效液相色譜法檢測游離棉酚。

1.2.4 油脂氧化對棉酚檢測的影響 精確稱取9 g玉米淀粉轉移至燒杯中，加入1 g（質量分數10%）棉籽油，攪拌均勻。鼓風干燥箱中120℃烘干4 h后采用苯胺法檢測樣品加熱前后的游離棉酚變化。

1.2.5 黃酮類對棉酚檢測的影響 稱取9.5 g玉米淀粉和0.5 g（質量分數5%）槲皮素轉到燒杯中，攪拌均勻，采用苯胺法檢測游離棉酚。

1.2.6 糖類對棉酚檢測的影響 稱取9.5 g玉米淀粉3份，分別加入0.5 g（質量分數5%）葡萄糖、0.5 g棉子糖和0.5 g蔗糖，轉移到燒杯中，攪拌均勻，采用苯胺法檢測游離棉酚。

1.3 數據處理 所有試驗均設置平行實驗（n=3），利用Microsoft Excel 2013進行收集整理，數據分析通過SPSS軟件進行，以“平均值±標準差”表示結果，采用one-way ANOVA方法比較組間的差異。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法和苯胺法檢測棉酚 高效液相法檢測棉酚含量按照國家標準規(guī)定，以乙醇作為溶劑萃取脫酚棉籽蛋白的游離棉酚后，通過液相色譜檢測含量，脫酚棉籽蛋白的檢測結果相對苯酚法的檢測結果都顯著偏低，平均偏低85%（P<0.05）。

相同條件下，將丙酮作為溶劑萃取游離棉酚，脫酚棉籽蛋白的液相色譜檢測結果相對苯胺法的檢測結果也都是顯著偏低，平均偏低89%（P<0.05），趨勢與乙醇萃取實驗的一致（表1）。這些結果表明苯胺法檢測游離棉酚的數值偏高，因此進一步對影響苯胺法檢測游離棉酚的因素進行分析研究。

表1 不同溶劑萃取脫酚棉籽蛋白的游離棉酚檢測結果 mg/kg

2.2 棉酚氧化物對棉酚檢測的影響 將棉酚以及在120℃常壓環(huán)境下氧化4 h后的棉酚，分別用苯胺法和高效液相色譜檢測游離棉酚含量。結果如表2所示，棉酚加熱前苯胺法和高效液相法檢測的游離棉酚含量相差不大；將棉酚氧化后，高效液相法檢測游離棉酚明顯低于棉酚氧化前的含量，苯胺法檢測結果比高效液相法的結果高出43.6%。這是由于棉酚在空氣中加熱，會在氧氣作用下氧化形成棉醌（Howell等，2000），顏色由淺黃色變深黃色。但棉酚上的醛基得到保留，保證棉醌依舊能夠與苯胺反應，影響游離棉酚檢測結果，導致與棉酚氧化前的結果基本相同。

表2 苯胺法和液相法檢測棉酚氧化物中的游離棉酚 mg/kg

2.3 油脂氧化對棉酚檢測的影響 將棉籽油在高溫環(huán)境下加速氧化，檢測加熱前后棉酚含量的變化。如表3所示，苯胺法檢測結果顯示烘干后游離棉酚的含量是烘干前的6.93倍（P<0.05），表明油脂氧化會導致檢測結果偏高。王美霞（2016）對棉籽油進行研究，發(fā)現其含有多種脂肪酸，主要成分為亞油酸、棕櫚酸、油酸，還有少量亞麻酸、花生酸。不飽和脂肪酸在棉籽油中的含量高達70%以上，其在氧氣存在下會氧化分解為一次產物，一次產物不穩(wěn)定會進一步氧化分解生成二次產物（羰基化合物），如酮、醛、酸等（王憲青等，2003）。醛類物質能夠與苯胺發(fā)生反應，使苯胺法檢測棉酚的結果偏高。

表3 油脂氧化對苯胺法檢測游離棉酚的影響mg/kg

2.4 黃酮類對棉酚檢測的影響 棉籽中存在多種黃酮類物質，包括槲皮素（Lukefahr，2016）、山奈酚（張慶建等，2001）、棉黃素（Khan，2013）等，其中槲皮素含量最豐富（額爾敦巴雅爾等，2021）。為確定黃酮類物質對苯胺法檢測的影響，在玉米淀粉中加入5%槲皮素后進行檢測。如表4所示，添加槲皮素之后，苯胺法測得的游離棉酚含量提高16.75倍（P<0.05），這表明黃酮類物質也能干擾苯胺法檢測游離棉酚，可能是由于黃酮上的酮基在加熱情況下與苯胺發(fā)生反應，使440 nm吸光度增加，導致檢測結果偏高。

表4 槲皮素對苯胺法檢測游離棉酚的影響mg/kg

2.5 糖類對棉酚檢測的影響 棉籽中含糖類較多，主要包括棉子糖、蔗糖、葡萄糖（Xu等，2022）。如表5所示，三種糖類中，棉子糖和蔗糖對游離棉酚檢測數值沒有影響，葡萄糖使游離棉酚檢測數值比空白對照升高12.9倍（P<0.05），明顯影響苯胺法的檢測結果。作為測試樣品三種糖中，棉子糖、蔗糖屬于非還原糖，只有葡萄糖是還原糖，還原糖在加熱過程中部分暴露醛基，與苯胺發(fā)生反應，導致游離棉酚結果偏高。

表5 糖類對苯胺法檢測游離棉酚的影響mg/kg

3 結論

本實驗結果表明，棉籽中存在的多種天然化合物都能干擾苯胺法檢測游離棉酚，包括棉酚衍生物、油脂氧化產物、黃酮類物質和還原糖。另外，苯胺容易變質，使用之前需要提純（朱利民等，2017），費時費力，且檢測誤差高達10%，逐漸無法滿足生產經營中對棉酚檢測及時性和準確性的要求。因此，測定棉籽相關產品中的游離棉酚，選用高效液相色譜法進行檢測更為快速和精確。