山西省擔子菌補記Ⅰ：2個華北地區新記錄種

武艷群 ，劉淑琴 ，孟俊龍 ，2，常明昌 ，2，王術榮 ，2

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技術研究中心，山西 太谷 030801）

從地理上講，華北地區一般指秦嶺—淮河線以北、長城以南的地區。華北地區氣候主要是以夏季高溫、多雨，冬季寒冷、干燥的溫帶季風氣候為主，年平均氣溫在 8～13 ℃，年降水量在 400～1 000 mm[1]。華北地區自然植被主要是以遼東棟、洋槐和柏樹等植物為代表形成的森林以及酸棗、荊條和茅草等為代表的灌木草原為主[2]。山西省位于華北地區西部的黃土高原上，黃河中游的東岸。山西省境內多山，有東部太行山，西部呂梁山，北部恒山、五臺山，南部中條山和中部的太岳山等[3]山脈。山西植被主要有溫帶草原和暖溫帶夏綠闊葉林2個植被地帶[4]。在我國華北地區獨特而優厚的自然環境中，大型真菌的種類和資源極其豐富，在大型真菌資源的利用上蘊藏著很大的潛力。

近些年來，在山西省發現報道了一批大型真菌的我國新記錄種和山西省新記錄種。2018年劉虹等[5]鑒定并分析了山西呂梁山脈的一種著名野生食用蘑菇，確定了其為山西省新記錄種，并將其命名為紅銀盤漏斗傘（Infundibulicybe hongyinpanL. Fan &H. Liu）；2019年8月，劉虹等[6]在研究考察山西毒蘑菇資源時，在中條山地區櫟樹林內地上采到一些黃色的鵝膏屬物種標本，經鑒定其為黃蓋鵝膏菌，并將其報道為山西省新記錄種。2020年，劉洋等[7]在歷山發現了山西省新記錄物種堿紫漏斗杯傘（Infundibulicybe alkaliviolascens（Bellù） Bellù）。2020年，王術榮等[8]在呂梁市龐泉溝自然保護區內采集到一個白鱗傘屬的物種，經鑒定該物種為華美白鱗傘（Leucopholiota decorosa（Peck） O.K. Mill.，T. J. Volk &Bessette），并報道為我國白鱗傘屬的一個新記錄種。

筆者在對2017—2020年采自歷山和呂梁山脈的大型真菌進行詳細的形態學和分子生物學鑒定，通過詳細的形態學描述和分子系統發育分析再次證明該地區大型真菌物種豐富度極高，旨在為后續的馴化等研究提供科學資料，對華北地區大型真菌物種資源的補充具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

3份供試材料分別是采集于山西省呂梁山國家自然保護區和歷山的大型真菌標本（標本號分別為HMSAU15012、HMSAU15014和 HMSAU15015）。目前，標本被儲存于山西農業大學的菌物標本館（HMSAU）。

1.2 設備與試劑

冷凍高速離心機（Thermo賽默飛世爾，ST16 ST16R）；生物安全柜（上海力康，HFsafe-1200LC）；超微量高精度紫外可見光分光光度計（Thermo賽默飛世爾，ND-ONE-W（A30221））；基礎電泳儀（北京君意東方，JY300HE）；凝膠成像分析系統（美國伯樂，Universal Hood II）；光學顯微鏡（日本，Nikon Eclipse Ni-U）；電恒溫鼓風干燥箱（博訊實業有限責任公司，GZX-9240MBE型）。

DNA提取試劑盒（美國OMEGA公司，Forensic DNA Kit D3591-02）；焦磷酸鈉（MACKLIN，7553-56-2）；2×EasyTaq PCR Super Mix（全式金生物，AS111-11）；Trans2K DNA Marker（全式金生物，BM101）；瓊脂糖（上海創賽科技有限公司，CB005-100G）；50×TAE（北京索萊寶科技有限公司，T1060）；DNA回收純化試劑盒（Omega Bio-Tek公司，Cycle-Pure Kit D6491-01*）；5% KOH（m/V）。

1.3 試驗方法

1.3.1 形態學觀察 對采集到的新鮮大型真菌標本進行觀察，拍照并且詳細地記錄其在自然環境中的生長狀況，包括其菌蓋表面顏色、大小、形狀以及菌褶顏色和菌柄長度等特征。觀察結束后用報紙小心仔細地包裹，并將其帶回實驗室內，用50 ℃烘干機烘干過夜，裝入袋內，再放于標本盒內保存。觀察時將干標本切片，使其在5%的KOH溶液中復水，用NikonEclipse Ni-U 光學顯微鏡對大型真菌的切片進行觀察，分別選擇不少于20個完整的擔子和孢子等顯微結構進行測量并記錄，計算孢子的長與寬的比值即Q值（Q值反映孢子的形狀）并計算其平均值Qavg[9]。

1.3.2 分子系統學分析

1.3.2.1 DNA提取 取5 mg干燥后的子實體標本 ，使 用 E.Z.N.A.?Forensic DNA Kit試 劑 盒（Omega），按照說明書步驟操作，提取DNA。用超微量高精度紫外可見光分光光度計對所提取的DNA進行濃度測定，之后于-20 ℃條件下儲存，以便為后續試驗做準備。

1.3.2.2 PCR擴增 將所提取的DNA進行濃度稀釋，稀釋到合適濃度的DNA作為模板，用引物對ITS8-F（5” -AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG GTG-3” ）/LR3（5” -CCGTGTTTCAAGACGGG-3” ）分別作為上游引物和下游引物對ITS區域進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增反應體系為25 μL：引物濃度為5 μmol/L的上、下游引物各 1 μL；DNA模板 2 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 11 μL，ddH2O為 10 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃，5 min；94 ℃，0.5 min，55 ℃，0.5 min，72 ℃，1 min，35個循環；72 ℃，10 min，4 ℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增后的產物，電泳程序為100 V，45 min。

1.3.2.3 PCR產物純化和DNA測序 將電泳檢測結果合格后的PCR產物用E.Z.N.A?Cycle-Pure Kit試劑盒（Omega）進行純化，純化后的DNA做好標記，后將其送到上海生工生物工程有限公司進行正向和反向測序[10]。

1.3.2.4 ITS序列處理 用Chromas軟件查看測序結果文件，確認測序結果的準確性，后將標本的ITS序列在MEGA X[11-12]軟件中進行復檢，經人工修正，排除程序誤讀，舍棄不理想的序列數據。利用NCBI數據庫中的BLAST工具，對所得序列進行同源性比對，確定其所在屬，并且從GenBank中得到該屬部分物種的基因組序列，同時選擇合適的其他屬物種的序列作為外類群，用MEGA X軟件中Clustal W程序對下載的序列進行校對和序列長度處理。然后進行模型選擇，選擇最佳模型，最后采用最大似然法[13]（Maximum Likelihood Method，ML），自舉值1 000次重建ML系統發育樹。用于分子系統發育分析的序列信息如表1所示。

表1 用于分子系統發育分析的序列信息Tab.1 Information of sequences used in the molecular phylogenetic analysis

2 結果與分析

2.1 灰小包腳菇 Volvariella murinella(Quél.) M.M. Moser ex Dennis，P.D. Orton & Hora

標本號：HMSAU15013、HMSAU15014；采集人：王術榮、何軼榕；采集時間：2020年8月31日；采集地點：山西省中陽縣上頂山；經緯度：北緯39°7′35″，東經 113°32′46″；海拔：2 050 m。

2.1.1 分子系統發育分析 通過人工復檢得到的堿基序列在NCBI數據庫中進行比對，結果表明，這 2份 標 本（HMSAU15013、HMSAU15014）的ITS 區序列與Volvariella murinella（OM214459）的序列相似度為97.2%。從NCBI數據庫下載部分該屬Volvariella的其他物種的基因序列，選用Cantharocybe gruberi（JN006422）作外類群[20]，建立系統發育樹（圖1），結果表明，本研究的2份標本HMSAU15013、HMSAU15014與其他灰小包腳菇Volvariella murinella（OM214459、MK412361）聚集于同一分支，且支持率為91%，說明標本HMSAU15013、HMSAU15014為灰小包腳菇（Volvariella murinella）。

圖1 基于ITS基因的最大似然分析（ML）獲得的灰小包腳菇與其相關物種的系統發育樹Fig.1 The phylogenetic tree of Volvariella murinella and related species obtained by maximum likelihood analysis of ITS gene region

2.1.2 形態學分析 宏觀特征（圖2）：子實體偏小。菌蓋直徑2.2～3.5 cm，呈鈍圓錐狀，菌蓋中部稍微突出，不黏，表面具有輻射狀灰色纖毛，白色至灰白色，中央米黃色至淡棕色，邊緣完整。菌肉薄，白色，氣味和味道不特殊。菌褶離生，稀疏，不等長，淡粉色，邊緣完整或略有鋸齒狀。菌柄中生，2.1～3.2 cm×0.3～0.4 cm，近圓柱形，基部近棒狀，白色，表面光潔或具有縱向纖毛，實心，較脆。菌托膜質，白色至淡灰色，不易脫落，開裂成2～3瓣。

圖2 灰小包腳菇子實體的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of Volvariella murinella fruiting body

微觀特征（圖 3）：擔孢子 6.1～7.9 μm×4.2～4.9 μm，Q 值為 1.3～1.8，Qavg為 1.5，不規則橢圓形或卵圓形，淡黃褐色，孢子壁光滑，較厚。擔子18.9～36.3 μm×6.8～10.4 μm，Q值為 1.9～3.9，Qavg為 2.6，棍棒狀，光滑，透明。側生囊狀體42.2～57.9 μm×16.3～18.1 μm，近棒狀或近紡錘形，壁薄，無色。褶緣囊狀體 22.5～39.5 μm×11.3～13.2 μm，形狀多樣，棒狀、寬棒狀至近紡錘形，壁薄，無色。無鎖狀聯合。

圖3 灰小包腳菇的微觀結構Fig.3 Microscopic structure of Volvariella murinella

生境：夏秋季單生或群生于闊葉林的枯枝、落葉上。分布：亞洲（中國山東）；歐洲（德國）[21]。

該種主要識別特征為擔子果小型至中型；菌蓋表面具輻射狀細微纖毛，白色，中央淡米黃色；菌柄色同蓋，光潔或具有縱向纖毛。在宏觀形態上，研究標本與模式標本相比較，除菌蓋直徑較模式標本（2.0～5.0 cm）略短外，其他宏觀特征均相似。在微觀形態上，研究標本和模式標本孢子的顏色和形狀極為接近，研究標本的擔子比模式標本的擔子（大小為 20.0～28.0 μm×6.0～10.0 μm）較長，這可能與測量誤差或環境因子有關。通過形態學和系統發育樹的構建，確定其為華北地區的新記錄種灰小包腳菇（Volvariella murinella）。在生境上，本研究標本采自闊葉樹的枯枝落枝，模式種采自林中或林緣的草叢、枯枝落葉層[22]。此物種味道辛辣至略苦[23]，食用價值尚不明胡。

2.2 東方球果傘Strobilurus orientalis Zhu L.Yang & J. Qin

標本號：HMSAU15012；采集人：王術榮、原淵；采集時間：2018年7月24日；采集地點：山西省晉城市沁水縣中村鎮下川村；經緯度：北緯35°26′32.96″，東經 112°01′10.67″；海拔：1 578 m。2.2.1 分子系統發育分析 將得到的堿基序列進行人工復檢后，在NCBI數據庫中進行比對發現該標本（HMSAU15012）的ITS區序列與Strobilurus orientalis（MF063170）的序列相似度為100%。從NCBI數據庫下載該屬Strobilurus的其他8條基因序列，選用Xerula strigosa（LK932286）作外類群[9,11]，建立系統發育樹（圖4），結果表明，標本HMSAU15012與其他東方球果傘（MF063170、MF063157）聚集于同一分支，且支持率為95%，說明標本HMSAU15012為東方球果傘（Strobilurus orientalis）。

圖4 基于ITS基因的最大似然分析（ML）獲得的東方球果傘與其相關物種的系統發育樹Fig.4 The phylogenetic tree of Strobilurus orientalis and related species obtained by maximum likelihood analysis of ITS gene region

2.2.2 形態學分析 宏觀特征(圖5)：菌蓋直徑為1.5～3.5 cm，錐形或傘形，淺褐色。菌褶直生近離生，不等長，灰白色，較密。菌肉薄。菌柄長3.0～5.5 cm，粗0.1～0.4 cm，圓柱狀，顏色不均勻，近菌蓋處為白色，向下為黃褐色。

圖5 東方球果傘子實體的形態特征Fig.5 Morphological characteristics of Strobilurus orientalis fruiting body

微觀特征（圖 6）：孢子 6.7～8.9 μm×5.3～6.8 μm，Q 值為 1.3～1.7，Qavg為 1.42，窄橢圓形，黃褐色，光滑。擔子37.5～43.9 μm×8.2～10.9 μm，Q值為3.4～5.6，Qavg為4.5，棒狀，透明，光滑；壁薄，有2～4個擔子小梗。側生囊狀體16.2～37.8 μm×6.9～10.8 μm，紡錘形，壁薄或者略厚，透明。褶緣囊狀體 14.5～36.2 μm×7.2～12.3 μm，紡錘形，形狀類似于側囊體，通常壁較薄，偶然厚。無鎖狀聯合。

圖6 東方球果傘的微觀結構Fig.6 Microscopic structure of Strobilurus orientalis

生境：夏季和秋季單生于云杉林中。分布：中國的云南、四川等地。

該種的主要特征為子實體較小，擔孢子也較小。在宏觀形態上，研究標本菌柄較模式標本（2.0～7.0 cm）略短，其他宏觀特征均相似，僅有極小的差異。在微觀形態上，研究標本和模式標本極為接近，研究標本的孢子比模式標本的孢子（大小為3.5～6.0 μm×2.0～4.0 μm）較大，這可能與測量誤差或環境因子有關。通過形態學和系統發育樹的構建，確定其為華北地區的新記錄種東方球果傘（Strobilurus orientalis）。在生境上，本研究標本采自云杉林中的落葉落枝上，模式種采自華山松的松果下[14]。此物種味道溫和[14]，食藥用價值尚不明確。

3 結論與討論

本研究通過對采集到的3份標本分別進行形態學觀察和建立系統發育樹分析，鑒定出其物種名稱分別為灰小包腳菇（Volvariella murinella）和東方球果傘（Strobilurus orientalis）。

灰小包腳菇（Volvariella murinella）隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agariciomycetes）傘菌目（Agaricales）小包腳菇屬（Volvariella）。王建瑞等[24]在山東省魯中南山地丘陵麻櫟林、落葉闊葉雜木林、油松和側柏疏林植被類型區采集到該物種；冶曉燕[25]在甘肅文縣某林中及邊緣落葉、草地上采集到該物種并將其報道為甘肅省新記錄種；本研究在呂梁山自然保護區采集的灰小包腳菇生長在闊葉林的落枝上，此后我國尚未有該物種的其他報道，需要更多研究來對該物種的分布及生境做補充。

東方球果傘（Strobilurus orientalis）的主要特征為擔孢子小，光滑，橢圓形，側生囊狀體壁厚。QIN等[14]在四川和昆明的云杉林中發現過此物種，此后未見有其他報道。本研究在歷山自然保護區采集到的東方球果傘也生長在云杉林中。目前該物種僅在我國西南地區的四川、云南和華北地區的山西省被發現，該物種其他分布地的發現尚需更多研究。

本研究報道的2種大型真菌均首次在華北地區的山西省被發現，屬于華北地區新記錄種。由此可見，該地區大型真菌物種豐富度極高，在大型真菌資源利用方面蘊藏著很大的潛力。本研究對華北地區大型真菌資源物種作了重要補充，為后續的馴化等研究提供了科學資料。