SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)

薛 蕊 楊國卉 李萬芳 楊春燕 魯碧楠 周文斌 許嘉鵬*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.云南省彝醫(yī)醫(yī)院/云南省彝族醫(yī)藥研究所，云南 楚雄 675000； 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050； 4.民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中央民族大學(xué))/中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081

隨著人們生活水平的進(jìn)步，飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患病率也在不斷增長，并呈年輕化趨勢(shì)發(fā)展。西醫(yī)治療此病的主要方法為急性期消炎鎮(zhèn)痛，間歇期降尿酸，但常伴隨消化道、肝腎損傷等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的治療信心。與之相比，傳統(tǒng)醫(yī)藥不僅能明顯改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的癥狀，又具有毒副作用低、可減少復(fù)發(fā)、價(jià)格實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。中藥的毒性有廣義與狹義的區(qū)分。廣義的“毒”為藥物的偏性和治療作用，狹義的“毒”為與治療無關(guān)的作用[1]。《素問》有言：“毒藥治其內(nèi)，針石治其外。”《諸病源候論》記載：“凡藥云有毒及大毒者，皆能變亂，于人為害，亦能殺人。”因此對(duì)中藥的毒性進(jìn)行深入探究，也是為臨床安全用藥提供有力保障。在臨床應(yīng)用中，通過中藥的配伍和(或)炮制的方法，來降低(消除)藥物的毒性作用，增強(qiáng)藥效，提升治療作用，從而保證患者的安全。

妙茯止痛顆粒是云南省楚雄州中醫(yī)醫(yī)院名老彝醫(yī)張之道和余惠祥專家的臨床經(jīng)驗(yàn)方，并以協(xié)定處方的形式在院內(nèi)使用，療效肯定。該方由土茯苓(洪賒牛)、紅萆薢(土澀)各30 g，醋莪術(shù)、炒蒼術(shù)、百合、車前子(自然熬)、大追風(fēng)(乃替力)各20 g，葉下花(帕陶唯)、威靈仙、黃柏各15 g組成，具有清熱除濕，化瘀散結(jié)等功效，對(duì)于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期濕熱閉阻證有良好的治療效果[2]。制成顆粒劑也更方便患者直接沖服，具有易于儲(chǔ)存、方便攜帶、干凈衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)[3]。為進(jìn)一步探究該組方的安全性，以《中藥、天然藥物急性毒性研究指導(dǎo)原則》[4]《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]等為根據(jù)，本試驗(yàn)對(duì)大鼠采取單次最大給藥量，觀察用藥后大鼠的毒性反應(yīng)，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境 SD大鼠40只，SPF級(jí)，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)201-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110011201100703。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，主要環(huán)境指標(biāo)的控制范圍：室溫20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。最小換氣次數(shù)15次/h，光照明∶暗=12 h∶12 h。

動(dòng)物飼養(yǎng)于聚丙烯大鼠群養(yǎng)盒中：籠具視格為:545 mm×395 mm×200 mm，每盒5只，其飼養(yǎng)空間符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2010中關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所需最小空間的規(guī)定，自由飲食和進(jìn)水。新領(lǐng)到的動(dòng)物檢疫期6 d，動(dòng)物反應(yīng)靈敏、攝食和健康狀況良好且無異常分泌物，大鼠皮毛光滑、確認(rèn)健康無病，可以用于試驗(yàn)。

1.2 藥品 妙茯止痛顆粒(批號(hào)：19110561，云南省彝醫(yī)醫(yī)院)，性狀:棕色顆粒。15～25 ℃遮光干燥保存。

1.3 儀器 賽多利斯電子天平。

2 方法

2.1 劑量設(shè)計(jì)及動(dòng)物分組大鼠單次給藥 臨床擬用劑量：642.86 mg/kg；給藥途徑：口服；臨床擬用療程：5 d；臨床主要適應(yīng)癥：痛風(fēng)性關(guān)節(jié)急性期濕熱痹阻證。劑量與分組：本試驗(yàn)采用最大給藥量法，每天給藥2次，1次給藥劑量20 g/kg。給藥濃度40 g/kg，給藥體積為10 mL/kg，給藥劑量相當(dāng)于臨床劑量的62倍。試驗(yàn)共設(shè)2組，每組20只大鼠，雌雄各半。具體見表1。

表1 SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)

2.2 供試品制劑配制 稱取一定量的供試品于研缽中，加入適量蒸餾水研磨，轉(zhuǎn)入量筒，再加蒸餾水沖洗研缽后轉(zhuǎn)入量筒，再加蒸餾水至所需體積；轉(zhuǎn)至棕色試劑瓶中，再用攪拌器混勻后使用，共配制2次(上下午各一次)并保證現(xiàn)用現(xiàn)配。取用供試品的數(shù)量、日期、使用人員、使用目的等均登記記錄，每次給藥后剩余的供試品制劑直接進(jìn)行廢棄處理并記錄。

2.3 動(dòng)物給藥及藥后觀察 采用灌胃給藥，給藥前禁食12～16 h，給藥2次(間隔4 h)，每次給藥體積為10 mL/kg；第二次給藥后3～4 h給予飼料。每次給藥后4 h內(nèi)籠旁觀察，嚴(yán)密觀察動(dòng)物對(duì)供試品的反應(yīng)，連續(xù)觀察14 d。主要觀察動(dòng)物外觀、行為活動(dòng)情況、呼吸狀態(tài)、分泌物、排泄物等。分別于接收時(shí)、分組時(shí)、給藥當(dāng)天、給藥后第1天、第4天、第7天、第11天、第14天動(dòng)物稱重，且保持相同時(shí)間。觀察期結(jié)束時(shí)，將存活動(dòng)物安樂死，并進(jìn)行解剖檢查，觀察心、肝、腎、脾、肺、胃腸等臟器的變化。

3 統(tǒng)計(jì)與分析

4 結(jié)果

4.1 動(dòng)物以一般狀況觀察 第一次給藥后給藥組所有動(dòng)物均未見明顯異常；第二次給藥后給藥組部分動(dòng)物在藥后可見活動(dòng)減少、豎毛，且4 h內(nèi)未恢復(fù)。給藥后第1天雌鼠No.23出現(xiàn)肛周污穢，雄鼠No.31～35出現(xiàn)肛周污穢；給藥后第2天雌鼠No.23出現(xiàn)肛周污穢，雄鼠No.34出現(xiàn)肛周污穢；給藥后第3～14天，所有動(dòng)物外觀、行為活動(dòng)情況、呼吸狀態(tài)、分泌物、排泄物等均未見異常。給藥途中未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。

4.2 剖檢結(jié)果 14 d觀察期結(jié)束后對(duì)全部動(dòng)物實(shí)施安樂死，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行尸解及大體觀察，所有動(dòng)物心、肝、腎、脾、肺、胃腸等臟器均未見明顯異常。

4.3 動(dòng)物體重 試驗(yàn)期間，給藥組雌雄鼠各階段體重與溶媒對(duì)照組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見表2、表3。

表2 SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)雌鼠體重表

表3 SD大鼠灌胃妙茯止痛顆粒單次給藥毒性試驗(yàn)雄鼠體重

5 討論

急性毒性試驗(yàn)是指單次或多次給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某種受試藥物后，觀察受試藥物在短時(shí)間內(nèi)對(duì)動(dòng)物所產(chǎn)生毒性反應(yīng)的一種試驗(yàn)方法[6]。用蒸餾水溶解并確定妙茯止痛顆粒單次最大給藥量實(shí)驗(yàn)濃度為2 g/mL，24 h內(nèi)灌胃兩次。此濃度為妙茯止痛顆粒能溶且可順利通過灌胃針頭的最大濃度；灌胃的最大給藥體積是10 mL/kg，故SD大鼠一天內(nèi)最大給藥量為40 g/kg，妙茯止痛顆粒臨床擬用劑量為642.86 mg/kg(成人)，使用下述計(jì)算公式：40(g/kg)÷642.86(mg/kg)≈62。SD大鼠24 h內(nèi)2次灌胃妙茯止痛顆粒的給藥劑量相當(dāng)于臨床劑量的62倍，在試驗(yàn)過程中第二次給藥時(shí)個(gè)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)肛周污穢，活動(dòng)減少的情況，但停藥后未出現(xiàn)臟器的異常變化及死亡。故妙茯止痛顆粒臨床擬用劑量較為安全。

土茯苓(洪賒牛)是臨床上治療痛風(fēng)的常用藥。研究[7-8]表明，單味土茯苓、萆薢土茯苓合二妙散加減、土茯苓飲等諸多方劑均對(duì)治療痛風(fēng)的療效明顯，且毒副作用小。其中紅萆薢(土澀)的萆薢總皂苷[9]對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有防治作用，可影響NALP3炎性體信號(hào)通路。劉敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)由黃柏和蒼術(shù)組成的二妙散是清熱燥濕藥的基礎(chǔ)名方，其水提液的最大耐受量為130.65 g/kg，在臨床上對(duì)于關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等具有良好的治療作用，可通過抑制 IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生從而減輕炎癥的發(fā)生與發(fā)展。通過查閱文獻(xiàn)，威靈仙中毒的報(bào)道也有一定的記載，威靈仙中所含的白頭翁素和原白頭翁素的主要功效是祛風(fēng)濕、止痹痛，也是產(chǎn)生毒副作用的主要來源，當(dāng)大量或過量的外敷內(nèi)服時(shí)，易產(chǎn)生過敏性皮炎、惡心嘔吐、心律失常等不良反應(yīng)[11-12]。但是原白頭翁素、白頭翁素具有一定的揮發(fā)性，增加煎煮時(shí)間，則可以降低其毒性[11-12]。于舒雁等[13]實(shí)驗(yàn)證明威靈仙提取液可通過降低血清炎癥因子的水平來緩解大鼠足趾的腫脹和屈伸不利的癥狀，降低痛閾，有良好的消腫止痛的作用。另外仝小林院士[14]以三味小方治療高尿酸血癥，方中土茯苓為15～60 g,威靈仙為9～30 g,萆薢為15～30 g。另外，一般威靈仙單次水煎劑量以15～30 g為宜[15]。李君玲等[16]通過對(duì)門診140例患者的回顧性分析，證實(shí)了該方能顯著降低尿酸水平，比西藥治療更加安全，可整體調(diào)節(jié)患者的癥狀。

大追風(fēng)(乃替力)是彝醫(yī)治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常用藥物[17]，具有通利關(guān)節(jié)的作用。楊本燕等[18]研究表明將透骨草、大追風(fēng)、飛龍斬血等藥用制成酊劑，對(duì)關(guān)節(jié)炎患處濕敷，并配合TDP治療，總有效率為 93.33%。李紅銳等[19]統(tǒng)計(jì)研究表明，葉下花對(duì)風(fēng)濕痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛和風(fēng)濕骨痛有一定的治療效果，是彝族特色藥物之一。莪術(shù)的行氣破血和消積止痛的功效顯著。馮洪山等[20]運(yùn)用苓皮除濕宣痹方加減治療關(guān)節(jié)炎癥，有良好的治療效果。喬文豪等[21]研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)具有抗血小板聚集的作用，所含有的莪術(shù)二酮影響凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化和聚集的標(biāo)志物、信號(hào)通路。百合是藥食同源的植物，藥膳百合赤豆湯，百合粥等均有緩解痛風(fēng)的效果[22-23]，另外百合車前草湯[24]臨床實(shí)踐證明能很好地改善患者因痛風(fēng)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)紅腫熱痛。陳紅梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)葎草百合湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎聯(lián)合秋水仙堿比單用西藥秋水仙堿臨床治療效果更佳，有效率為86.6%。費(fèi)洪新等[26]研究表明車前子對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)腫脹作用效果明顯。車前子配方顆粒[27]通過抑制IL-12水平來改善小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，并且對(duì)機(jī)體的副作用較小。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)中藥成方的臨床療效方面研究較多，中藥顆粒劑的毒性研究、湯劑與顆粒劑的效果對(duì)比研究也較少，部分藥物的毒性劑量研究尚不精確，有待日后進(jìn)一步探究。