MAML1與胃癌進展和預后相關性的生物信息學分析

陳 梅 張 昱 李冬梅 張文靜,3

1 昆明理工大學醫學院(昆明 650500) 2 云南省第一人民醫院，昆明理工大學附屬醫院消化內科(昆明 650032) 3 云南省第一人民醫院，昆明理工大學附屬醫院腫瘤內科(昆明 650032)

胃癌(gastric cancer，GC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。幽門螺桿菌(helicobacte rpylori，Hp)感染是GC發生的獨立危險因素[1- 2]，盡管根除Hp能夠顯著降低GC的發生率，但對于已經發生癌變的患者來說，根治Hp對胃癌的治療并無明顯幫助；而且約一半以上的患者初次就診時已是中晚期，失去了根治性手術切除的機會。雖然針對人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor- 2，HER- 2)的靶向療法聯合化療對HER2陽性的胃癌患者帶來了一定的臨床獲益[3- 5]；相比于單獨化療，程序性細胞死亡-1/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death protein 1/ programmed cell death protein ligand 1, PD-1/PD-L1)抑制劑聯合化療也提高了高度微衛星不穩定(microsatellite-high，MSI-H)的晚期胃癌患者的客觀緩解率[6- 7]，但僅有極少數患者存在HER2陽性或MSI-H，而且治療后均存在耐藥現象。基于上述原因，目前晚期胃癌患者的總生存期(overall survival，OS)仍不盡如人意。因此，尋找新的預后和治療靶點，能夠為制定臨床決策提供一定的理論幫助。

NOTCH信號通路參與胃癌的多個生物學過程，包括細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移以及血管形成。Mastermind-like 1(MAML1)是一種轉錄共激活因子，能夠與所有哺乳動物均有的四個NOTCH受體錨蛋白重復結構域結合，與ICN和RBP-Jkappa形成DNA結合復合物，并放大NOTCH誘導的HES1轉錄，從而充當NOTCH信號的轉錄共激活因子[8- 9]。然而，MAML1在胃癌中的表達、生物學功能及潛在分子機制目前罕有報道。本研究應用生物信息學方法分析MAML1在胃癌中的表達及與胃癌患者臨床特征及預后的相關性，并預測了MAML1的潛在關聯基因、信號通路及腫瘤浸潤淋巴細胞。為進一步體外研究MAML1在胃癌中的生物學功能及分子機制提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 MAML1在胃癌組織和正常組織中的表達

癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數據庫是大型癌癥基因組計劃的免費數據門戶[10]。我們從TCGA數據庫獲取了具有RNA-Seq表達和相匹配臨床病理信息的胃癌患者數據。通過The Human Protein Atlas數據庫中MAML1在胃癌和正常胃組織中的免疫組化結果觀察其表達和分布情況。

1.2 MAML1在GSE15459數據集中的表達水平與預后的關系

從GEO數據庫下載數據集GSE15459，該數據集芯片信息如下：GLP570(Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，包含200例原發性胃癌的基因表達信息[11]。根據MAML1的中位表達水平，將胃癌患者分為MAML1高表達組(MAML1-high)和MAML1低表達組(MAML1-low)，使用Kaplan-Meier進行對其總生存期(overall survival, OS)進行分析，以探索MAML1表達水平與胃癌患者生存期之間的關系。

1.3 蛋白質相互作用分析

使用在線工具STRING探索與MAML1可能存在相互作用的蛋白[12]，設置Pearson相關系數>0.5，預測的蛋白數量為50。

1.4 MAML1相關基因的功能注釋

利用Funrich在線工具分析MAML1相關基因所富集的功能和通路[13]。

1.5 TIMER 數據庫分析

腫瘤免疫浸潤評估資源(tumor immune estimation resource，TIMER)涵蓋 32 種癌癥類型并包含來自 TCGA 數據庫的10 897個樣本[14-15]。通過TIMER數據庫評估胃癌患者中 MAML1的表達水平與六種浸潤免疫細胞(CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞巨噬細胞和中性粒細胞)豐度的相關性，并評估MAML1表達水平與腫瘤純度之間的關系，聯合GEPIA數據庫分析MAML1表達與腫瘤浸潤免疫細胞之間的關系。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MAML1在胃癌中的表達水平

首先，TCGA數據庫在線分析結果提示：MAML1的表達水平在膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)、多形成性膠質細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)、腎乳頭狀細胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)、急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、低級別腦膠質瘤(brain lower grade glioma，LGG)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、肉瘤(sarcoma，SARC)、胃癌(stomach adenocarcinoma，STAD)、胸腺癌(thymoma，THYM)等多種惡性腫瘤顯著高于相匹配的正常組織(圖1A，P<0.05)。在The Human Protein Atlas數據庫中免疫組化染色提示(圖1B)：MAML1在胃癌組織中呈高表達，且以細胞核分布為主。與上述結果類似，MAML1 mRNA在胃癌組織中的表達水平同樣高于正常胃組織(圖1C，P<0.001)。

2.2 MAML1高表達的患者預后較低表達患者差

隨后，下載GSE15459數據并進生存曲線分析，結果提示：與MAML1-low組胃癌患者相比，MAML1-high患者的生存期更短(圖2A，P=0.01)。在亞組分析中，臨床III期的胃癌患者在MAML1-low和MAML-high人群間顯示出總體生存率的顯著差異(P=0.02，圖2D)，而在I、II和IV期患者中未見顯著性差異(P>0.05，圖2B、C、E)。在有淋巴結轉移的患者中，MAML1-low組的OS明顯優于MAML-high組(圖2G)，而無淋巴結轉移的患者未見顯著性差異(圖2F)。相反，在無遠處轉移的患者中，MAML1-low組的患者OS優于MAML1-high組(圖2H)，但有遠處轉移的患者中未見顯著性差異(圖2I)。另外，無論患者是進行手術切除還是進行了術后以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為基礎的化療，均存在MAML1-low組的患者生存顯著優于MAML-high組患者(圖2J、K)。以上結果提示，MAML1高表達的胃癌患者提示較短的生存期，且MAML1表達水平可能與III期胃癌患者的OS及淋巴結轉移存在正相關，而與患者是否接受手術治療或化療無明顯關系。

圖2 MAML1表達水平在胃癌患者的預后分析注：MAML1表達水平與(A)總體人群、(B)臨床I期、(C)II期、(D)III期、(E)IV期患者、(F)無淋巴結轉移N0、(G)有淋巴結轉移(N1+2+3)、(H)無遠處轉移(M0)、(I)有遠處轉移(M1)、(J)僅接受手術治療、(K)接受時候輔助化療的患者OS的相關性。

2.3 MAML1相關作用蛋白的預測及功能和信號通路富集分析

為探討MAML1的高表達導致胃癌患者預后差的分子機制，我們應用STRING數據庫分析了相關系數位居前50的MAML1作用蛋白(圖3A)。其中，位居前十位的分別是：NOTCH1、RBPJ、EP300、NOTCH2、HEY1、NOTCH4、HES5、MAML2、MYC和HEY2。其相關系數均大于0.94，而且大多數是NOTCH信號通路成員。

隨后，FUNRICH軟件對上述50個預測基因進行生物學功能和信號通路的富集分析顯示：90.2%的MAML1相關基因分布在細胞核中，34.1%位于核仁(圖3B)；分子功能方面，22.4%的基因參與轉錄因子活性，16.3%的基因參與轉錄調節活性(圖3C)；在信號通路富集方面，38.5%的基因參與雄激素受體途徑(P<0.001)、30.8%參與C-MYB轉錄因子調控途徑(P<0.05)、23.1%參與HIF- 2-alpha 轉錄因子網絡等途徑(圖3D)；生物功能過程方面，44.9%的基因參與核堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝的調節(圖3E)。上述發現表明，與MAML1相關的基因大多位于細胞核中，發揮轉錄調控功能，可能扮演激活劑或共激活劑的轉錄協同因子的作用。

圖3 胃癌組織中MAML1的潛在作用蛋白及其富集分析注：(A)按相關系數排名的前50個MAML1潛在關聯蛋白的網絡構建；50個關聯蛋白在(B)細胞分布、(C)分子生物學功能、(D)生物學信號通路和(E)生物學功能方面的富集分析。

2.4 MAML1表達水平與腫瘤浸潤免疫細胞表達的相關性分析

研究表明，腫瘤浸潤淋巴細胞的高低與免疫檢查點抑制劑的療效有一定的相關性。因此，我們進一步分析了MAML1表達水平與六種浸潤性免疫細胞(CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)和腫瘤純度的相關性。結果顯示(圖4)：MAML1與B細胞(r=0.133，P=0.001)、CD4+T細胞(r=0.298，P<0.001)、巨噬細胞(r=0.119,P=0.002)的表達水平存在顯著的正相關關系，但與腫瘤純度、CD8+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞無顯著相關性(P>0.05)。

圖4 MAML1與胃癌純度、不同浸潤免疫細胞(B細胞、CD8+T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞)間的相關性分析

隨后，我們應用GEPIA分析了MAML表達水平與B細胞、巨噬細胞及各種功能性T細胞基因標記之間的關系。其中，GEPIA數據庫中功能性T細胞包括 Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh、T細胞耗竭和Treg細胞。見表1：在胃癌中，MAML1表達水平與大多數免疫細胞標記物相關。MAML1表達水平與PD-1、TIM3、CTLA4等T細胞耗竭的細胞標志物顯著相關；還與STAT3、STAT6、STAT5A顯著相關。以上發現提示：MAML1的表達水平可能與腫瘤免疫逃逸、PD-1/PD-L1/CTLA1抑制劑治療的療效有關。

表1 MAML1與GEPIA 中免疫細胞基因標記之間的相關性

3 討論

靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療為HER2陽性和MSI-H的晚期胃癌患者的治療帶來了新的曙光。然而，HER2陽性或MSI-H的胃癌患者不足10%，絕大部分患者并無明確的治療靶點；而且胃癌的發生和轉移涉及復雜多變的分子網絡及調控機制。因此，尋找新的分子標記物并探討其與腫瘤微環境的關系顯得尤其重要。本研究探索了NOTCH信號通路中的一個關鍵分子——MAML1在胃癌中的表達水平和其相關蛋白及腫瘤免疫浸潤細胞的關系，不僅拓展了NOTCH信號通路的研究內容，而且為MAML1有可能成為胃癌預后指標、潛在治療靶點及免疫治療療效指標提供了理論基礎。

據報道，MAML1在食管鱗癌中異位過表達，且與食管癌患者的不良預后、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度和腫瘤分期顯著相關[16-17]。敲低MAML1能夠下調CD44+腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)的遷移能力，并降低細胞對5-FU的耐藥性[18]，表明MAML1有可能成為靶向CSCs的食管癌治療靶點。該研究中，生物信息學分析發現MAML1在胃癌組織中呈異常高表達，并且與較差的總體生存率密切相關。既往研究表明，NOTCH信號通路參與多種惡性腫瘤干細胞的自我更新、細胞增殖和分化[19- 20]，并介導了化療和靶向藥物的耐藥性[21- 22]。而MAML1作為NOTCH信號通路中的重要組成部分，介導了該途徑下游基因的激活和腫瘤的發生發展。此外，MAML1還是β-連環蛋白(β-catenin)，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和p53途徑的激活因子[23- 25]。Wnt/β-catenin、NF-κB和p53信號通路參與多種惡性腫瘤的發生發展、腫瘤耐藥及干細胞特性，其上述功能的發揮主要是通過在細胞核內積聚，從而影響下游癌基因或抑癌基因的轉錄水平。該研究通過富集分析發現，MAML1相關蛋白主要分布在細胞核，并主要參與轉錄功能，與上述報道的機制及功能方向基本一致。由此可見，MAML1能夠介導多種信號通路和多種生物反應之間的相互影響，有可能在胃癌的發生、轉移和耐藥過程中發揮一定的生物學作用。

STRING分析發現細胞周期蛋白依賴性激酶8(cyclin-dependent kinase 8，CDK8)是MAML1的相互作用蛋白之一；同時，CDK8是急性粒細胞白血病的治療靶標[26]。SEL120- 34A是一種新型的CDK8抑制劑，能夠通過抑制STAT1 S727和STAT5 S726反式激活的磷酸化，從而抑制細胞增殖并影響干細胞特性[27]。該研究中，GEPIA分析發現MAML1表達水平與STAT3、STAT6、STAT5A顯著相關，或許也可能參與了SEL120- 34A的藥理作用，但需要進一步的體外和體內實驗驗證。有研究表明，在人黑色素瘤細胞系M537中，敲低MAML1的表達能夠增加transwell小室中的NK和CD8+T細胞數量，從而影響腫瘤細胞的遷移能力[28]。該研究發現，MAML1的表達水平與B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞的浸潤水平具有顯著一致的相關性。對免疫細胞標志物的進一步分析表明，MAML1與PD-1、TIM3、CTLA4等T細胞耗竭的標志物之間亦存在顯著相關性。以上發現提示：MAML1可能參與調節腫瘤微環境，從而影響PD-1/PD-L1/CTLA4抑制劑的療效，因此有可能將來成為免疫治療的療效預測指標之一。

總之，我們首次揭示了MAML1在GC患者中異常高表達，可能是預后不良的預測因素。MAML1的作用蛋白參與多種分子生物學過程和信號通路，還可能在分子轉錄層面和調節腫瘤免疫微環境方面發揮了重要作用。深入研究MAML1及相關蛋白在胃癌中的功能及分子調控機制將有利于進一步了解胃癌的發病和耐藥機制，為尋找新的胃癌預后和治療靶標提供了理論依據。