低氧調控p53RFP基因啟動子活性的初步研究

裴靜嫻 莫 沛 王月剛

1 廣州醫科大學附屬第二醫院心血管內科(廣州 510260) 2 南方醫科大學南方醫院心血管內科(廣州 510515)

低氧是心血管疾病發病過程中一個常見的病理生理因素，特別是在心肌梗死、心力衰竭發病過程中發揮重要的作用[1]。HIF-1α 作為調節細胞對低氧適應性反應的重要轉錄因子，通過與低氧反應元件(hypoxia responsive element,HRE)核心DNA序列5′-RCGTG- 3′結合激活基因轉錄[2]，從而調節多種下游靶基因的表達，參與了紅細胞生成、鐵代謝、葡萄糖代謝、血管生成、細胞增殖與凋亡等多種生理病理過程[3- 4]。

p53RFP是調控細胞增殖和凋亡的一個重要基因[5]，最初被鑒定為受p53調控的基因，其產物具有E3泛素連接酶活性，通過泛素化降解細胞周期調控因子p21WAF1/CIP1 參與細胞增殖和凋亡。生物信息學分析顯示p53RFP啟動子區域存在多個低氧反應元件，而p53RFP基因表達是否受低氧的調控尚未見相關報道。因此，本研究擬觀察低氧對p53RFP基因表達及p53RFP啟動子活性的影響，并探索HIF-1α潛在的結合位點HRE在低氧調控p53RFP基因啟動子活性中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

HEK293細胞、E.coli DH5α 由本課題組保存，pGL3-p53RFP 載體由本課題組前期構建；pRL-SV40、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；定向突變試劑盒購于Stratagene公司；Lipofectamine 2000、TRIzol、質粒中提試劑盒均購于Invitrogen公司；質粒小提取試劑盒購自Biomiga公司；逆轉錄試劑盒購自Takara公司；熒光定量PCR試劑盒購自 Roche公司；ECL發光試劑盒、 PVDF膜購自Millipore公司；兔抗HIF-1α多克隆抗體購自Abcom公司；小鼠抗p53RFP單克隆抗體購自Abnova公司；小鼠抗β-actin 單克隆抗體、羊抗鼠辣根過氧化物酶標記二抗、羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗均購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 低氧對HEK293細胞p53RFP mRNA及蛋白表達的影響 將HEK293細胞消化為單細胞懸液、計數，以4×105細胞總數接種于60 mm細胞培養皿，置于常規細胞培養箱(37 ℃，5% CO2，21% O2)培養24小時，細胞換新鮮培養基。將細胞置入低氧培養箱(37 ℃，1% O2，5% CO2，94% N2)分別培養0、3、6、12小時，TRIzol法提取細胞總RNA，細胞裂解液提取細胞總蛋白。

1.2.1.1 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 以RNA為模板逆轉錄合成cDNA，應用熒光定量PCR試劑盒，以β-actin基因為內對照，行 Real-time PCR，反應條件：95 ℃ 10 min；95℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。引物序列如下：p53RFP 上游5′CATCTGGACCCCTACCGAACA 3′,下游5′ACACGAGCAGAATTTCAGGTG3′；β-actin 上游5′CAAATGCTTCTAGGCGGA CTATG 3′，下游5′TGCGCAAGTTAG GTTTTGTCA 3′。

1.2.1.2 Western blot 檢測蛋白表達 將蛋白加入SDS加樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，取20 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜，依次5%脫脂牛奶封閉2～3 h， 一抗(HIF-1α稀釋比例為1:700；p53RFP稀釋比例為1:500；β-actin稀釋比例為1:1000)孵育過夜，TBST 洗 膜10 min×3次，二抗(稀釋比例為1:10000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3次，ECL發光。

1.2.2 構建突變型p53RFP啟動子熒光素酶報告基因載體 p53RFP啟動子區域-1118/-1115 、-636/-633存在2個低氧反應元件特征序列，我們將可能的HRE核心序列5′-RCGTG- 3′分別突變成RTACA，構建p53RFP啟動子HRE單突變型(pGL3-p53RFPM)或雙突變型熒光素酶報告基因載體(pGL3-p53RFPM2)。以野生型p53RFP啟動子1230bp截短片段的熒光素酶報告基因載體(pGL3-p53RFP)為模板，設計針對 -1118/-1115 區域HRE 突變引物，引物序列如下：上游引物5′GGTGCCTGTTGGTACACACAGATCCTTTCC 3′；下游引物：5′GGAAAGGATCTGTGTGTACCAACAGG-CACC3′，按照定點突變試劑盒操作說明，PCR擴增突變DNA。PCR結束后，向擴增產物中加入2 μL Dpn I，37 ℃水浴5分鐘，切掉未突變的超螺旋雙鏈DNA。將Dpn I處理的DNA轉化超級感受態細胞，轉化產物涂Amp+LB培養板，37 ℃培養14～16 h。挑取單克隆，接種至LB液體培養基，小提質粒，送華大基因公司測序。

以-1118/-1115 區域HRE 突變成功的p53RFP 啟動子熒光素酶報告基因載體(pGL3-p53RFPM)為模板，設計針對- 636/- 633 HRE位點的突變引物，引物序列如下：上游引物5′CAGTTGTCTGCCATACAGGAAGGCAGGTC3′；下游引物5′GACCTG CCTTCCTGTATGGCAGACAACTG3′，構建HRE雙突變型啟動子報告基因(pGL3-p53RFPM2)。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測低氧對p53RFP基因啟動子活性的影響 按照Lipofectamine 2000操作說明，將250 ng野生型及突變型p53RFP啟動子熒光素酶報告載體分別轉染48孔細胞培養板的HEK293細胞，共轉染25 ng pRL-SV40作為內參，以pGL3-Basic轉染組作為陰性對照。分別置于常規細胞培養箱及低氧培養箱培養。轉染24小時后收集細胞，應用雙熒光素酶檢測試劑盒，經化學法發光儀檢測螢火蟲及海蜃光子數，以螢火蟲光子數與海蜃光子數的比值作為相對熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 低氧對HEK293細胞p53RFP及HIF-1α基因表達的影響

實時熒光定量PCR檢測低氧對HEK293細胞p53RFP mRNA表達的影響，結果顯示：低氧處理不同時間點p53RFP mRNA 表達水平均顯著增加(F=96.493,P<0.001)，與低氧0 h組相比，低氧培養3 h、6 h、12 h的p53RFP mRNA表達水平均顯著升高，差異有統計學意義(P分別為0.01，<0.001,<0.001)，見圖1A。

Western blot 檢測低氧對HEK293細胞p53RFP及HIF-1α蛋白表達的影響，結果顯示：與常氧組相比，低氧組不同時間點p53RFP及HIF-1α蛋白表達水平均明顯上調，且呈時間依賴性遞增趨勢,見圖1B。

圖1 低氧對p53RFP 基因表達表達的影響條帶旁邊標注蛋白大小注：A，熒光定量PCR檢測低氧處理不同時間p53RFP mRNA表達水平的變化，與0小時相比， **P<0.01， ***P<0.001；B，Western blot 檢測低氧處理不同時間p53RFP及HIF-1α蛋白表達水平的變化

2.2 突變型p53RFP基因啟動子熒光素酶報告基因載體構建

基因測序結果經NCBI 基因序列對比，結果顯示pGL3-p53RFPM 單突變載體啟動子區域-1118/-1115 HRE核心序列5′-RCGTG- 3′突變成RTACA，pGL3-p53RFPM雙突變載體啟動子區域-1118/-1115 、-636/-633 HRE核心序列5′-RCGTG- 3′均突變成RTACA，證明HRE單突變型(pGL3-p53RFPM)及雙突變型(pGL3-p53RFPM2)熒光素酶報告基因載體構建成功。載體示意圖見圖2，測序結果見圖3。

圖2 p53RFP基因啟動子熒光素酶報告載體示意圖

2.3 低氧對p53RFP基因啟動子轉錄活性的影響

雙熒光素酶檢測結果顯示：與常氧組野生型p53RFP啟動子活性相比，低氧組野生型p53RFP基因啟動子活性顯著增加(t=-19.504,P<0.001)，盡管低氧仍能增加pGL3-p53RFPM及pGL3-p53RFPM2 啟動子活性，但低氧條件下，HRE單突變或雙突變均較野生型p53RFP啟動子活性顯著下降(F=160.891,P<0.001)。

圖3 突變型p53RFP基因啟動子熒光素酶報告基因載體測序結果 注：A:pGL3-p53RFPM 測序結果，-1118/-1115 HRE(CGTG)突變為TACA(下劃線處)； B、C: pGL3-p53RFPM2測序結果，-1118/-1115 及- 636/- 633HRE(CGTG)均突變為TACA(下劃線處)

圖4 低氧對野生型及突變型p53RFP啟動子活性的影響注：與常氧組pGL3-p53RFP啟動子活性比較， ***P<0.001；與低氧組pGL3-p53RFP啟動子活性比較， ###P <0.001

3 討 論

低氧是機體最常見的病理生理過程，大多數情況下，短暫的缺氧和HIF-1α低氧信號通路的激活是有益的。然而，在某些慢性損傷、慢性缺氧及病理修復的情況下，低氧途徑的激活可能導致組織纖維化及器官功能損傷[6]。大量研究表明低氧通過介導HIF-1α的穩定表達在急性心肌缺血中減輕梗死面積、保護心功能。但也有證據表明在慢性缺血中HIF-1α的長期激活可促進心肌重構和心功能惡化。動物實驗顯示HIF-1α的持續激活可能參與了缺血性心肌病的發病過程，同樣在慢性缺血性心肌病患者的尸檢組織中也檢測到了心肌HIF-1α蛋白的高表達[10]。同樣，低氧也是心臟肥厚的病理特征，有研究表明HIF-1α參與了壓力超負荷誘導的心肌肥厚[11]。此外，Lei等構建了心肌細胞特異性 VHL基因缺失小鼠，結果顯示VHL基因缺失小鼠嚴重心衰的發生與HIF-1α的持續表達直接相關[12]。因此， HIF-1α在急性心肌缺血中既發揮了心臟保護作用，也可能參與了心梗后續心衰的發生發展過程。然而，HIF-1α通過激活哪些信號通路參與了缺血性心肌病的發病過程目前尚不明確。

p53RFP是受p53家族成員調控的一個基因，具有E3泛素連接酶活性。研究表明p53RFP 通過泛素化降解Bax、p21、p63，在調控細胞凋亡、細胞周期中發揮重要作用。我們的研究顯示低氧可促進p53RFP mRNA及蛋白表達增加，其mRNA表達上調更加顯著，提示低氧對p53RFP基因表達的調控可能主要發生在轉錄水平。同時，低氧條件下，HIF-1α與p53RFP蛋白表達趨勢均呈時間依賴性。生物信息學分析顯示p53RFP基因啟動子區域存在多個低氧反應元件。因此，我們推測低氧可能通過HIF-1α介導了p53RFP基因轉錄激活。

為此，本研究在野生型p53RFP雙熒光素酶報告載體的基礎上[15]，構建了低氧反應元件突變型的p53RFP雙熒光素酶報告載體。我們通過雙熒光素酶報告基因檢測了低氧對野生型及突變型p53RFP啟動子活性的影響，結果顯示低氧可顯著增加野生型p53RFP基因啟動子活性，HRE單突變或雙突變后，p53RFP啟動子活性顯著下降。以上研究結果表明低氧可能通過啟動子區域的低氧反應元件調控p53RFP基因表達，p53RFP啟動子區域位點的-1118/-1115、- 636/- 633 位點的低氧反應元件可能是HIF-1α潛在的結合位點，提示p53RFP可能是HIF-1α直接調控的一個靶基因。因此，我們推測p53RFP作為調控細胞增殖和凋亡的一個重要基因，可能參與了低氧誘導的細胞損傷過程。

綜上所述，本研究首次表明低氧可能通過HIF-1α介導了對p53RFP基因的轉錄調控。野生型及突變型p53RFP雙熒光素酶報告基因載體的成功構建，為下一步深入研究低氧調控p53RFP的分子機制及生物學效應奠定了基礎。