基于ITS2序列的鬼箭羽及其混偽品DNA條形碼鑒定

郭麗嶸 ，趙偉 ，楊麗 ，陳海娟 ，楊志剛 ， ，李一蒙， ，

1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海 西寧 810016；3.青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；4.蘭州大學(xué)隴藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

鬼箭羽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.的干燥具翅狀物的枝條或翅狀物[1]。全國除東北、新疆、青海、西藏、廣東及海南外，其余各地均產(chǎn)，具有較高的藥用、觀賞及經(jīng)濟(jì)價值。鬼箭羽含有豐富的化學(xué)成分，包括黃酮類、甾體類、木脂素類、強(qiáng)心苷類、生物堿類、苯丙素類、萜類、揮發(fā)油類、酚酸類等[2-3]。古籍記載鬼箭羽主要用于治療女子?jì)D科經(jīng)血疾病及殺蟲驅(qū)邪。藥理研究表明，鬼箭羽提取物有明顯的降血糖、降血脂、降血壓、抗過敏、抗炎及保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞等作用，在治療糖尿病、慢性腎炎、盆腔炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等方面效果顯著[4-6]。衛(wèi)矛屬植物眾多，分布廣泛，植物形態(tài)相似，極易混淆，鑒別難度大。《千金翼方》記載，鬼箭羽與天麻苗均具有赤箭、鬼督郵等別稱。明代《本草崇原》將天麻苗描述為“赤箭。春生苗，中抽一莖直上如箭竿，色正赤，貼莖梢之半，微有小紅葉，遠(yuǎn)看如箭之有羽，根形如王瓜，皮色黃白，曬干則黑，去根三五寸，有游子環(huán)列如衛(wèi)，皆有細(xì)根如白發(fā)，氣相通而實(shí)不相連”，由此可知，蘭科植物天麻在形態(tài)上與鬼箭羽相似。這導(dǎo)致正品與偽品混用現(xiàn)象層出不窮，給用藥安全帶來很大隱患。因此，為控制鬼箭羽藥材質(zhì)量，建立一種快速準(zhǔn)確的鑒別方法尤為重要。

傳統(tǒng)的藥材鑒別手段主要包括性狀鑒定、基原鑒定、顯微鑒定及理化鑒定等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA條形碼分子鑒定法的出現(xiàn)對傳統(tǒng)鑒別手段進(jìn)行了有效補(bǔ)充。DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA片段對物種進(jìn)行鑒定，不受樣品的形態(tài)和性狀的影響[7-8]。目前，植物類中藥材常選用細(xì)胞核基因組中的ITS2（Internal Transcribed Spacer 2）和葉綠體基因組中的psbA-trnH基因區(qū)間序列進(jìn)行鑒別。本研究將DNA條形碼技術(shù)用于鬼箭羽藥材的鑒別，比較鬼箭羽與其近源種的親緣關(guān)系，建立快速鑒別鬼箭羽及其混偽品的方法，為后續(xù)鬼箭羽的質(zhì)量控制及安全用藥提供分子依據(jù)。

1 儀器與試藥

GE9612T-S型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（北京柏恒科技有限公司），ChampGel 6000型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），D1524R型高速冷凍離心機(jī)（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Vortex 3000型渦旋混合器（WIGGENS labortechink GmbH公司），Nano-400A型超微量核酸分析儀（杭州奧盛儀器有限公司），Smart-S15型超純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

Genomic DNA Kit試劑盒（批號P81019）、DNA凝膠回收試劑盒（批號03921KE1），北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；GelstainRed核酸染料（批號210611L1-7），上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；100 bp Marker（批號01000/60531），康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；KOD-Plus-Neo（批號067000），TOYOBO；西班牙瓊脂糖（批號111860）、50×TAE電泳緩沖液（批號21335470）、6×DNA loading buffer（批號01454/36320），蘭州勵合生物科技有限公司。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

16批鬼箭羽藥材，分別為來源于四川、河南、山東、江西等地的野生種（見表1），經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院李建銀講師鑒定，為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.的干燥具翅狀物的枝條或翅狀物。鬼箭羽近源種西南衛(wèi)矛Euonymus hamiltonianus、歐洲衛(wèi)矛Euonymus europaeus、白杜衛(wèi)矛Euonymus maackii、冬青衛(wèi)矛Euonymus japonicus、衛(wèi)矛Euonymus alatus、扶芳藤Euonymus fortunei、紫花衛(wèi)矛Euonymus porphyreus、栓翅衛(wèi)矛Euonymus phellomanus及混偽品大果榆Ulmus macrocarpa序列均來源于GenBank數(shù)據(jù)庫（見表2）。

表1 鬼箭羽樣品來源信息

表2 鬼箭羽近源種及其偽品序列信息

2 方法與結(jié)果

2.1 ITS2序列分析

2.1.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

用酒精擦拭藥材表面，待藥材表面酒精揮干，粉碎后過5號篩，稱取樣品粉末約20 mg，使用全式金Genomic DNA Kit試劑盒提取總DNA。使用通用引物ITS2F （5” -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3” ） 和ITS3R（5” -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3” ）進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性2 min；98 ℃、10 s，55 ℃、30 s，68 ℃、45 s，33個循環(huán)；94 ℃，5 min，4 ℃保存。DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將擴(kuò)增的基因送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行一代測序。

2.1.2 種內(nèi)及種間遺傳距離分析

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為450～470 bp，條帶清晰無裂解（見圖1），表明ITS2序列擴(kuò)增效果好，純化回收后測序可獲得高質(zhì)量的堿基序列。測序后去除兩端5.8S和28S rDNA區(qū)段獲得ITS2標(biāo)準(zhǔn)序列，其長度為212 bp，GC含量為67.4%～67.9%。序列對比結(jié)果表明，16條序列僅在第100個位點(diǎn)處存在差異，其中，GJY4、GJY5、GJY6、GJY9、GJY10、GJY14為C，其他樣品為T，共獲得2個單倍型（見圖2），表明不同產(chǎn)地所產(chǎn)鬼箭羽的種內(nèi)變異率低，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。基于K2P雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，不同產(chǎn)地不同藥材市場鬼箭羽的種內(nèi)最大K2P為0.004 7，平均K2P為0.002 4，種間最大K2P為0.126 2，種間平均K2P為0.082 1，鬼箭羽與混偽品最小K2P為0.405 8，最大K2P為0.430 6，見表3～表4。

表3 鬼箭羽樣品種內(nèi)遺傳距離

表4 鬼箭羽與近源種和混偽品的遺傳距離

圖1 鬼箭羽樣品ITS2擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳

圖2 鬼箭羽樣品間ITS2序列對比

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

測序峰圖利用CodonCode Aligner 3.0校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，獲得一致性序列。所有序列使用隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列，其中5.8S rRNA的保守序列為CGAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCA，28S rRNA的保守序列為CGACCCCAGGTCAGG CGGGAACACC。將得到的所有序列用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 7.0軟件分析比對后用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

使用MEGA 7.0軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫選取的8種近源種及1種偽品和16批鬼箭羽藥材ITS2序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹（見圖3）。系統(tǒng)聚類樹結(jié)果表明，GJY1～GJY16與西南衛(wèi)矛、歐洲衛(wèi)矛、白杜衛(wèi)矛、冬青衛(wèi)矛、扶芳藤、栓翅衛(wèi)矛、紫花衛(wèi)矛并為一個大分支，可以明顯看出，GJY1～GJY16與衛(wèi)矛屬材料親緣關(guān)系較近，而其偽品大果榆自成一支，表明ITS2序列作為DNA條形碼，能將鬼箭羽與其混偽品分開。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的鬼箭羽及其混偽品NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則已被列入2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則，在中藥鑒定方面廣泛研究與應(yīng)用，為傳統(tǒng)中藥鑒定學(xué)的發(fā)展提供了新的理論和技術(shù)支撐[9-10]。劉金欣等[11]通過建立黃芩ITS2數(shù)據(jù)庫并對黃芩種子的ITS2序列進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)黃芩的種內(nèi)序列變異小于種間序列變異，構(gòu)建的黃芩ITS2條形碼數(shù)據(jù)庫穩(wěn)定可靠，表明DNA條形碼可用于黃芩種子的物種鑒定。孫稚穎等[12]通過鑒定羌活及其混偽品的ITS2序列并比較了ITS2的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)羌活種內(nèi)平均遺傳距離遠(yuǎn)小于與其混偽品的種間平均遺傳距離，ITS2結(jié)構(gòu)上也有明顯差異，表明ITS2序列作為DNA條形碼可方便快捷地鑒別羌活與其混偽品。

1963年版《中華人民共和國藥典》將鬼箭羽的來源描述為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛的干燥具翅狀物枝條[13]。1993年版《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（二）》記載鬼箭羽藥材來源為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛E. alatus、同屬植物栓翅衛(wèi)矛E. phellomanus及同屬植物毛脈衛(wèi)矛E. alatusvar.pubescens[14]。2009年版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》亦有類似說明[15]。目前，鬼箭羽基原已基本確定為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛，隨著臨床應(yīng)用日益增多，在市場流通過程中常有榆科植物大果榆的莖冒充鬼箭羽，值得注意的是，大果榆的干燥莖亦具有不規(guī)則木栓翅，判定時仍存在困難，使用時應(yīng)注意鑒別[16-17]。

本研究采用DNA條形碼技術(shù)，通過對不同產(chǎn)地不同藥材市場16批鬼箭羽ITS2序列分析，發(fā)現(xiàn)其種內(nèi)保守性高，種內(nèi)變異率低，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，可以將非變異材料的ITS2序列作為對照序列來鑒定正品鬼箭羽。此外，從K2P遺傳距離可以看出，本研究16批鬼箭羽樣品與其近源種的種內(nèi)種間遺傳距離遠(yuǎn)小于與其混偽品的遺傳距離，在NJ系統(tǒng)聚類樹上也可以看到16批鬼箭羽與其近源種成一個大分支，混偽品自成一支，其中，以往被作為鬼箭羽入藥的栓翅衛(wèi)矛與衛(wèi)矛聚為不同的支，而衛(wèi)矛與16批鬼箭羽樣品聚為一支，能夠明顯區(qū)分，可為后續(xù)研究提供參考。