基于RNA干擾抑制油菜種皮色素合成

申 敏， 柴友榮

(1.長治職業技術學院，山西長治 046000； 2.西南大學農學與生物科技學院，重慶北碚 400700)

油菜在分類學上屬于十字花科蕓薹屬。油菜是一種重要的食用油原料、蛋白質飼料和一種理想的生物柴油原料。它屬于全球最主要的油料作物之一。中國既是油菜的主要生產國，也是主要的消費國。油菜是產油效率最高的作物之一，菜籽油是我國的傳統使用油，在人民生活和我國國民經濟中占有舉足輕重的地位。

大量研究表明，黃籽油菜的含油量高于傳統的黑籽和褐籽油菜，黃籽油菜色素少，榨出的油顏色清亮，而且種皮薄、纖維素含量低、蛋白質含量高、菜籽油富含多酚且營養價值高，所以培育高產優質黃籽品種是油菜育種界的目標[1]。油菜籽經壓榨后，餅粕與食用油分離，餅粕中的大量蛋白質作為飼料營養價值非常高。近年來世界性能源危機，導致工業用油非常緊張，油菜生產為其提供了新的解決思路[2]。

甘藍型黃籽油菜遺傳背景復雜，較難穩定遺傳，且目前沒有天然油菜黃籽突變體。迄今為止，關于甘藍型油菜種皮色澤在分子層面的研究報道并不多見[3]，對種皮顏色合成機理還沒有統一看法。類黃酮代謝是植物次生代謝中最廣泛的次生代謝途徑之一，絕大多數植物中含有類黃酮化合物。類黃酮主要在植物生長、發育以及抗生理逆境等方面起重要作用[4]。植物器官表面顏色主要成分是原花青素、花青素與黃酮醇。擬南芥是甘藍型油菜的模式植物，據報道由于擬南芥中一些基因突變，導致種皮色素核心成分原花青素下降，種皮呈現透明或半透明[5]。這種由于種皮中原花青素含量的下降導致種皮呈現種胚顏色的突變，被稱為透明種皮突變。

RNA干擾是指外援或內源性的雙鏈RNA進入細胞后引起同源RNA特異性降解的現象，表現為特定基因的缺失。這在生物體內是一種普遍存在的生理機制。在后基因時代，RNA干擾正在成為一個非常有效的基因功能研究工具[6]，具有特異性高、穩定性高、效性高、可穩定遺傳等優點。目前主要用于植物的性狀改良等方面。

擬南芥中TT2基因編碼MYB蛋白，主要參與調控類黃酮代謝途徑后期結構基因的表達，如BAN、DFR，從而達到調控種皮原花青素、花青素苷的積累。擬南芥tt2突變體種子顯示透明種皮性狀，即黃籽性狀[7]。擬南芥與甘藍型油菜同屬十字花科蕓薹屬植物，兩者基因組序列保守性非常高，許多基因功能極為相似。因此，對甘藍型油菜TT2基因進行功能鑒定，是篩選黃籽油菜位點的重要途徑，可為推動甘藍型黃籽油菜育種進程，以及研究甘藍型黃籽油菜種皮色澤穩定遺傳提供理論基礎[8]。隨著人們對油菜基因組學研究的深入和RNAi技術的不斷完善，RNAi在黃籽油菜的育種應用中前景更加廣闊，同時也為黃籽油菜育種帶來更大的科研價值和經濟價值，有助于揭示蕓薹屬種皮色素合成機理，加速分子育種的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所采用的植物材料為中雙10號油菜種，根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404、植物RNA干擾平臺載體為筆者所在課題組改造而成，改良型植物載體由本課題組提供，克隆載體等購自TaKaRa公司。

PCR儀、水浴鍋、恒溫培養箱、超低溫冰箱、紫外與可見分析裝置等。

EasyTaq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、DL-2000 plus DNA marker，植物DNA抽提試劑盒；植物RNA抽提試劑盒(小量)；反轉錄PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 甘藍型油菜TT2基因RNA干擾 發苗：無菌條件下種子清水浸泡培養6～8 d的幼苗用于預培養。預培養：將10 cm左右的幼苗切為 0.5 cm 長的下胚軸切段，于培養基中光照培養48～72 h。農桿菌侵染：暗培養約2 d→轉接1次(1/100體積接種量)→二次培養，培養至D600 nm=0.8～1.0左右(約6～8 h)，將外植體轉接于鋪有無菌濾紙的共培養基上。共培養：接種完成后暗培養48 h。

共培養后的外植體浸殺農桿菌后于誘導抗性愈傷中光培養14 d以上，至長出肉眼可見的抗性愈傷。誘導出肉眼可見抗性愈傷的外植體轉接于分化培養基上，根據構建載體中抗生素篩選壓不同設計甘藍型油菜TT2RNA干擾分化培養基。待外植體分化出莖后轉接繼代培養，光照培養直至分化長出較長的莖與葉片。再將分化出莖與葉的幼苗繼代于分化根培養基中，光照培養至長出5～7條主根為止。最后水培馴化及移栽在馴化室。

1.2.1 轉基因陽性植株獲得 因載體構建時加入抗Basta基因，將濃度為 200 mg/L 的Basta溶液均勻涂抹于再生植株嫩葉表面，48～72 h后觀察葉片的變化情況，以及再生植株是否具有Basta抗性。用DNA小量抽提試劑盒提取再生植株的基因組總DNA，經電泳和分光光度計檢測DNA的質量，確保所提DNA能滿足PCR擴增的要求。采用TT2基因特異引物組合F35S3N+FBTT2I，以再生植株的DNA基因組為模板檢測RNA干擾轉化得到的再生植株是否為轉基因陽性植株。

檢測程序：再生苗檢測引物(F35S3N，FBTT2I)94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 45 s，35個循環；72 ℃再延伸 10 min，16 ℃ 10 min。

1.2.3 再生植株T1種籽粒色性狀考察和千粒質量的測定 在體視顯微鏡下轉基因陽性種子與陰性種子一同拍照。收獲后的T1代種子脫粒去雜質后獲得1 000粒種子，然后稱質量。不足1 000粒的樣本，求平均值后乘以1 000得到千粒質量。

1.2.4 種子切片觀察 使用低溫冷凍切片機將轉基因陽性種子切為 5 mm 薄片，在熒光顯微鏡下觀察測量種皮厚度。

1.2.5 木質素含量測定 木質素含量測定參照Morrison的方法[9]，略有更改。稱取干燥后種皮 1.0 g，加入95%乙醇中勻漿，上離心機離心后將沉淀物用95%乙醇沖洗3次，再使用乙醇、正己烷配比后的混合液沖洗3次后，使其緩慢干燥。取干燥后材料0.10 g，溶于0.5 mL 25%溴乙酰冰醋酸溶液中，高溫恒溫水浴一段時間。加NaOH終止反應。再加入冰醋酸和羥胺鹽酸，使用冰醋酸作為定容液定容至10 mL，多次離心后取上清液，用紫外分光光度計測定吸光度D值。按回歸方程y=0.086 3x+0.088計算種皮中木質素的含量，其中，y為280 nm下的D值，x為種皮木質素的百分含量[10]。

1.2.6 原花青素含量測定 原花青素含量采用香草醛-鹽酸法測定：(1)配制顯色試劑：A為1%香草醛，B為8%鹽酸溶液，顯色液為A ∶B=1 ∶1?，F用現配。(2)提取物中原花青素含量的測定：種皮勻漿粉碎后，用70%乙醇反復沖洗提取后離心獲得上清液定容，從定容液中取1 mL顯色分析。(3)分光光度劑測定原花青素含量：取樣液1 mL，加入顯色劑5 mL，搖勻避光放置，在低溫水浴鍋中水浴 30 min，取出在500 nm波長下測定其吸光度，按照標準曲線算出樣品中原花青素的含量。(4)繪制標準曲線：配制原花青素標準溶液，用乙醇溶解原花青素標樣，濃度為0.6 mg/mL，分別取1、2、3、4、5 mL，定容至10 mL，分別從定容液中取 1 mL 加入5 mL顯色劑。同樣在低溫水浴后測得吸光度，繪制標準曲線[11]。(5)計算原花青素百分含量[11]。

1.2.7 轉基因植株基因表達分析

1.2.7.1 RNA提取、純化及反轉錄 使用華舜公司的植物組織RNA抽提試劑盒，要求提取再生陽性植株的總RNA貯存于-80 ℃。

根據試劑盒指導將提取的總RNA反轉錄為cDNA。反轉錄程序為37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；放于-20 ℃保存或者直接檢測cDNA質量。

1.2.7.2 定量Q-PCR檢測轉基因植株TT2基因抑制水平 分別以野生型甘藍型油菜和陽性轉基因油菜的cDNA為模板，同時采用定量PCR法以引物組合(FBnTT2A，RBnTT2A)檢測轉基因中TT2基因的表達情況。

2 結果與分析

2.1 RNA干擾材料獲得

使用濃度為200 mg/L Basta溶液分別涂抹于再生植株嫩葉表面進行抗Basta篩選，48～72 h后觀察葉片的變化。轉基因植株中載體片段含Basta抗性基因，植株嫩葉有損傷但可自愈；野生植株葉片完全不抗Basta，葉片出現枯萎死亡(圖1)。初步篩選陽性轉基因植株。對再生植株進行PCR 陽性鑒定，擴增條帶為466 bp，與目標條帶一致(圖2)，共篩選到25株陽性轉基因苗。

2.2 轉基因材料表型鑒定

通過對比發現，RNA干擾轉基因植株種皮顏色變淺，呈現紅棕色或紅褐色(圖3)。表明RNA干擾抑制種皮色素合成，色素積累減少，推測種皮中類黃酮代謝途徑基因表達抑制。通過對比還發現，種子個體明顯變小，千粒質量下降，結實率降低。轉基因陽性植株千粒質量 (2.332 g)比野生型植株(2.910 g)平均低0.578 g。陽性植株結實率(37.92%)比野生型植株(54.4%)低16.48百分點。表明RNA干擾技術可能影響種子內容物積累，影響種子結實率與千粒質量。

2.3 種子冷凍切片

為研究RNA干擾TT2基因對種皮的影響，對轉基因陽性植株收獲種子進行石蠟冷凍切片。熒光顯微鏡下發現轉基因RNA干擾陽性苗種皮厚度明顯降低，柵欄組織稀疏。陽性植株種皮厚度均值(44.56 μm)比野生型植株種皮厚度(45.77 μm)低1.21 μm(圖4)。表明RNA干擾技術影響種皮厚度，對柵欄層組織形成有影響。

2.4 木質素含量分析

由表1可知，轉基因材料種皮木質素含量均值(16.35%)比野生型材料(20.42%)低4.07百分點。表明沉默TT2基因會影響種子種皮中木質素含量。苯丙烷途徑包括類黃酮途徑和木質素代謝途徑，TT2的缺失可能影響到木質素代謝途徑中下游靶基因的表達，進而影響種皮中木質素的含量。

表1 木質素含量測定

2.5 原花青素含量分析

由表2可知，轉基因植株種皮原花青素含量均值(5.47%)比野生型植株原花青素含量(7.42%)低1.95百分點?；ㄇ嗨靥禺愋苑e累在內種皮，擬南芥研究表明，AtTTG2基因功能失活后會導致擬南芥種皮由野生型的深褐色種子轉變為透明種皮(黃籽)。TT2、TT8、TTG1這3個轉錄子共同調控幼種中幾個類黃酮結構基因在內種皮的表達。這與前面的種皮顏色考察結論一致，進一步證明RNA干擾沉默TT2基因影響種皮色素合成。

表2 原花青素含量測定

2.6 TT2基因組織表達特異性分析

甘藍型油菜TT2基因在油菜幼種中特異性表達，取花后15 d的幼種，提取RNA反轉錄得到cDNA，采用熒光定量PCR檢測TT2基因表達情況。實時定量PCR檢測TT2基因表達結果(圖5)顯示，轉基因陽性植株TT2基因整體表達下調，在個別陽性植株內出現TT2基因表達接近沉默。表明RNA干擾技術可以作為一種有效抑制或關閉目標基因的沉默技術。

3 討論

TT2基因編碼R2R3-MYB蛋白，是調控發育中種子原花青素積累的關鍵因子，種子特異表達，轉錄出現在內皮層，主要影響種皮色素沉積和種坯發育[10]，決定類黃酮生物合成酶BAN基因的正確表達，影響原花青素生物合成與轉運。

本研究采用基因沉默方法，RNAi是由雙鏈RNA介導的特異基因沉默現象，是一種轉錄后水平基因沉默技術，相對于反義和共抑制技術，沉默效率更高。RNA干擾引發mRNA降解，這種方法可用做于開啟或關閉目標基因。在擬南芥與水稻這些模式植物中，RNA干擾技術被用來研究基因功能和產生新的表型[10]。干擾片段在300～500 bp之間的干擾效果最好[11]，甘藍型油菜中TT2基因片段為466 bp。RNAi效率比反義RNA高得多，且穩定性好。植物界基因家族干擾現象很普遍[12-13]，RNAi既可用于對不同成員進行分別沉默，也可用于對整個家族進行有效沉默。

本研究使用課題組構建好的工程菌株轉化中雙10號，得到轉基因陽性植株。在轉化過程中培養基2周更換1次[14]，可以縮短遺傳轉化周期，減少有毒代謝物質的積累，防止抗生素篩選壓失效，減少假陽性苗出現[15]。

本研究表明，RNAi基因沉默TT2基因，導致甘藍型油菜種皮顏色變淺，種子變小，飽滿度減少，結實率降低。分子層面上抑制TT2基因的表達，甚至直接關閉目標基因表達。種皮切片顯示，所有轉基因陽性植株種皮變薄，柵欄組織疏松，這與TT2基因在種子內種皮特異性表達預測結果[16-17]一致。種皮原花青素含量降低，說明TT2基因缺失導致種皮中色素積累減少，顏色變淺。木質素含量降低，表明木質素代謝途徑作為苯丙烷通路的分支受到TT2基因缺失的影響[18]，可能與TT2基因調控的下游靶基因關閉有關[19]。這與黃籽與黑籽油菜的區別相一致。

原花青素是油菜種皮黑褐色色素的主要成分，種皮色素越少，種皮顏色更透明，油菜籽初榨油品質更好，色澤更清澈[20]。菜籽餅中色素越低，木質素含量越低，抗營養劑就越少，菜籽油和餅粕的經濟價值更高。餅粕蛋白質含量越高，營養成分越容易被動物吸收，為動物成長提供更多的能量。目前世界能源緊張，黃籽油菜高產油量可以提供生物柴油緩解能源危機。通過現代基因工程方法抑制油菜種皮色素積累，阻斷類黃酮代謝途徑，得到低木質素、低纖維素、低種皮色素和高產優質、穩定遺傳的黃籽油菜，具有較高的研究價值和經濟價值。RNA干擾作為植物功能基因組研究與發展是一種非常有潛力的技術。構建特異RNA干擾載體沉默甘藍型油菜種皮色素基因表達為加快黃籽油菜的分子育種進程提供依據[21]，將來可更多運用在一些物種提高營養品質、綜合品質和抗病抗蟲等方面。