4株促紫花苜蓿生長的芽孢桿菌分子鑒定及其生物活性分析

陳 蘭，謝永麗,2，吳曉暉，楊 雪，王 添，武玲玲

(1.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，西寧 810016；2.青海大學 農牧學院，西寧 810016)

農牧業是青海省重要的支柱產業，然而高海拔地區牧草生長期短，產草量低，加上鼠害、過度放牧等因素影響，加劇了高寒草地植被退化、畜牧業發展不平衡現象[1]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科植物，其莖葉中含有多種營養物質，作為牧草飼料或直接用于青飼、干草都可為畜禽的生長發育提供營養，同時，利用人工種植紫花苜蓿可以提高退化植被恢復率、防止水土流失，改良鹽堿地等[2]。作為青海省的優良栽培牧草，紫花苜蓿具有一定的經濟價值和生態價值，然而青藏高原海拔高、氣溫低、干旱等極端生境造成紫花苜蓿的正常生長發育受到限制，導致植株死亡率大幅增加[3]。陳華等[4]從枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株JA中分離出抗生素，研究發現其可對灰霉病菌(Botrytiscinerea)產生拮抗作用，從而提高植物抗病性；黃秋斌等[5]研究發現蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)菌株B3-7能夠定殖在小麥(Triticumaestivum)根系，降低小麥紋枯病(wheat sharp eyespot)的侵染，并可提高小麥生物量。因此，利用有益微生物與優良牧草互作，對于提高牧草抗病性、促進牧草生長，增強牧草對鹽堿、低溫、干旱等特殊生境的抗性，改善貧瘠土壤的理化性以及提高牧草養份的釋放效率均具有重要意義。

青藏高原特殊生境孕育著特殊適生性微生物資源。芽孢桿菌是一類廣泛存在于土壤中的植物根際促生菌，應對不利條件會產生具有特殊抗性的內生孢子，因此，在農業、畜牧業的價值和應用極為重要[6]。芽孢桿菌屬分為多個亞群，其中絕大多數菌株都具有特殊生防功能[7]，能夠產生次級代謝產物脂肽化合物(lipopeptide)，對病原菌正常生長產生干擾或直接破壞其生存環境，抑制病原菌進一步擴展，從而間接促進植物生長[8-9]，通過生物固氮的方式為土壤提供有機氮，不僅促進土壤營養元素循環、改善土壤肥力，還可定殖在植物根系提供氮元素，促進植物吸收利用[10]。王繼雯等[11]研究發現對小麥施用固氮芽孢桿菌菌株C2菌劑會明顯促進其主根的生長，同時可提高土壤養分含量。因此，利用具有良好生防功能的本土芽孢桿菌，對于防治植物病害、提高作物生物量及優化貧瘠土壤具有重要意義。此外，芽孢桿菌可產生胞外纖維素酶等能夠有效降解植物木質纖維素[12]，將此類生防芽孢桿菌應用于飼草料加工、秸稈降解中，不僅能減輕青海高原秋冬季節家畜飼草料供應不足的問題[13]，還能改良土壤肥力[14]。因此，篩選利用能降解纖維素的芽孢桿菌菌源，是提高秸稈還田效率、促進畜牧業可持續發展的重要措施。本研究以分離自青海烏蘭荒漠沙地白刺(Nitrariatangutorum)根際的4株芽孢桿菌菌株為供試菌，以菌懸液(濃度為1×107cfu/mL)對紫花苜蓿灌根測定其對牧草促生效果，測定菌株拮抗4種病原真菌活性、固氮能力、降解纖維素活性及耐鹽、低溫適生性，對菌株進行16S rDNA及gyrB分子鑒定，以期篩選出對高原特殊環境有強適應性和適生性的拮抗芽孢桿菌，為促進紫花苜蓿生長、退化植被恢復、飼草料加工等提供優質菌源。

1 材料與方法

1.1 材 料

芽孢桿菌：菌株WL81、WL911、WL92、WL99分離自青海烏蘭荒漠地白刺(N.tangutorum)根圍。

病原真菌：禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)分離自小麥(Triticumaestivum)、銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum)分離自梭羅草(Roegneriathoroldiana)、鏈格孢(Alternariaalternata)分離自老鸛草(Geraniumwilfordii)、黑曲霉(Aspergillusniger)分離自高山嵩草(Kobresiapygmaea)。

培養基及試劑：LB培養基[6]；低溫1C培養基[15]；PDA培養基[16]；改良阿須貝(Ashby)無氮固體培養基[17]；CMC-Na培養基[18]。

儀器：ZHWY-200D 恒溫振蕩培養箱；SIGMA 3K15 離心機；PRX-800A 智能人工氣候箱。

草種：紫花苜蓿(Medicagosativa)種子由青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 芽孢桿菌促紫花苜蓿生長測定 芽孢桿菌菌懸液制備：在37 ℃、180 r/min條件下，將菌株WL81、WL911、WL92和WL99在LB液體中活化14 h，倒入50 mL 離心管，10 ℃、6 000 r/min 離心5 min，棄上清，無菌水洗菌體3次，加入適量無菌水、渦旋1～2次制成懸浮液，以LB液體為對照，測定OD600的吸光度值，將濃度調成 1×107cfu/mL(OD600=1.0)[19]，備用。

芽孢桿菌促紫花苜蓿生長：用70%(體積比)的H2SO4溶液浸泡紫花苜蓿種子10 min，無菌水沖洗3次，加入100 mL 0.1%(體積比)的H2O2消毒5 min，用無菌水沖洗干凈；天然土與蛭石按質量比(2∶1)比例混勻后滅菌；隨機選取20粒處理后的紫花苜蓿種子播入穴盆中，置于智能人工氣候箱中培養(26 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗)。待幼苗株高達到3～5 cm，用45 mL菌懸液對植株進行灌根處理，對照組用同體積的無菌水處理；繼續培養7 d后，取出紫花苜蓿幼苗，保持植株干凈完好，測量其株高、根長，吸干根表水分后測定鮮質量[19]。

1.2.2 芽孢桿菌拮抗活性測定 打取直徑為 7 mm禾谷鐮孢(F.graminearum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)、鏈格孢(A.alternata)、黑曲霉(As.niger)的菌餅，分別接種在新的PDA平板中央，置于28 ℃培養2 d；以菌餅為中心的4個對稱點作為接種點，各放置一個直徑4 mm的濾紙小圓片。分別挑取菌株WL81、WL911、WL92和WL99的單菌落置于含有5 mL LB液體培養基的試管中，在37 ℃，180 r/min活化14 h，吸取5 μL菌液接在濾紙片中央，繼續培養2 d后，取出觀測并記錄抑菌數據[16]。

1.2.3 芽孢桿菌固氮能力測定 將菌株WL81、WL911、WL92和WL99單菌落接種至 5 mL LB液體培養基中搖培14 h，作為菌懸液。在Ashby無氮固體培養基中央放置一個直徑為4 mm的濾紙小圓片；吸取5 μL菌懸液分別接種于濾紙片，在37 ℃條件下培養7 d。觀察并測量菌落的生長，根據所形成的透明圈大小，檢測其固氮能力[17]。

1.2.4 芽孢桿菌降解纖維素活性測定 在CMC培養基中央放置一個直徑4 mm的濾紙小圓片，分別吸取5 μL搖培后的WL81、WL911、WL92和WL99菌懸液點接在濾紙片中央，置于37 ℃恒溫箱內培養3 d后，取出后注入Gram碘染液，靜置4 min，倒去染液。測量并記錄透明圈及菌落直徑，確定比值A[18]。

1.2.5 芽孢桿菌耐逆性測定 耐鹽性測定：配制梯度NaCl的質量濃度為0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15 kg/L的LB液體培養基，挑取4株菌株單菌落分別接種到不同濃度梯度的5 mL LB液體培養基中，活化14 h；將100 μL菌液涂布于對應鹽濃度的固體LB平板，倒置于37 ℃恒溫箱內培養5 d。每天觀察并記錄菌株生長和擴展，測定菌株的耐鹽性[20]。

耐低溫測定：將4株菌株單菌落分別接種到含有5 mL低溫1C液體培養基的試管中，活化 14 h；取5 μL菌液接種在1C固體培養基上，以溫度梯度4、10、14、18 ℃下培養5 d。每天觀察并記錄生長情況，測定菌株的耐低溫性[6]。

1.2.6 芽孢桿菌分子鑒定 16S rDNA序列鑒定：菌株WL81、WL911、WL92和WL99的基因組DNA提取參照張瑞福等[21]方法進行，利用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，反向引物1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[22]，引物序列及供試菌的基因組DNA由上海美吉生物公司進行合成并測序。將所獲得的拼接序列在GenBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行在線比對，以MEGA 7.0(Mega Limited, Auckland, New Zealand)軟件構建系統發育樹。

gyrB基因序列鑒定：利用正向引物UP(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGG NGGNAARTTYGA-3′)，反向引物UP2r(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGC CRTCNA CRTCNGCRTCNGTCAT-3′)[22]；引物序列及供試菌的基因組DNA由上海美吉生物公司進行合成并測序。序列比對與系統發育樹分析同上述 方法。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌促紫花苜蓿生長效應

菌懸液對紫花苜蓿幼苗灌根處理后培養7 d，紫花苜蓿幼苗生物量的測量結果表明，4株菌株對紫花苜蓿幼苗生長均具有促進作用。其中，菌株WL911對紫花苜蓿幼苗生長的促進作用最為顯著(P<0.05)，處理組的紫花苜蓿幼苗平均株高、根長、鮮質量分別達到11.62 cm、6.67 cm、0.06 g，與對照組相比分別增加60.7%、100.8%、100.0%(圖1和表1)。4株菌株對紫花苜蓿幼苗的地上、地下部分及鮮質量均具有促進作用，可積累植物生物量。

表1 4株芽孢桿菌菌株促紫花苜蓿幼苗生長效率

A.對照；B.菌株WL81促紫花苜蓿生長；C.菌株WL911促紫花苜蓿生長；D.菌株WL92促紫花苜蓿生長；E.菌株WL99促紫花苜蓿生長

2.2 芽孢桿菌拮抗病原真菌活性

拮抗病原真菌活性測定結果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99對禾谷鐮孢、銳頂鐮孢、鏈格孢和黑曲霉均具有一定的拮抗活性。其中菌株WL911對4種病原真菌的抑菌圈直徑均在15 mm以上，較大程度抑制病原菌的生長和擴散，表現出顯著拮抗活性。4株芽孢桿菌菌株對分離自不同植物的4種病原真菌均具有拮抗作用(圖2和表2)。

A.拮抗禾谷鐮孢；B.拮抗銳頂鐮孢；C.拮抗鏈格孢；D.拮抗黑曲霉

表2 4株芽孢桿菌菌株對病原真菌的拮抗活性

2.3 芽孢桿菌固氮能力

固氮能力測定結果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99均具有良好的固氮能力。將4株菌株接種于改良Ashby無氮固體培養基平板上培養7 d后發現其均能產生透明圈，形成的透明圈直徑分別為20、29、23、22 mm，表明4株菌株均可在無氮培養基中正常生長(圖3)。

A.菌株WL81形成的透明圈；B.菌株WL911形成的透明圈；C.菌株WL92形成的透明圈；D.菌株WL99形成的透明圈

2.4 芽孢桿菌降解纖維素活性

降解纖維素活性測定結果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99均能夠降解纖維素。將4株菌株接種在CMC-Na培養基平板中央進行培養，使用Gram Iodime染色后，均產生明顯的透明圈，其直徑分別為28、40、29、31 mm，說明芽孢桿菌產生纖維素酶將CMC-Na水解產生還原糖，使其無法附著染料而形成透明圈。其中，菌株WL911的降解纖維素活性最為明顯，其A值為3.33(圖4和表3)。

A.菌株WL81形成的透明圈；B.菌株WL911形成的透明圈；C.菌株WL92形成的透明圈；D.菌株WL99形成的透明圈

表3 4株芽孢桿菌菌株降解纖維素活性

2.5 芽孢桿菌的耐逆性

2.5.1 耐鹽性 耐鹽性測定結果表明，菌株WL81只能在鹽濃度為0.03、0.05、0.07、0.09、0.11 kg/L的培養基上生長，其余3株菌株在鹽濃度為0.13 kg/L培養基上均可正常生長，表現出良好的耐鹽性。其中，菌株WL911在鹽濃度為0.15 kg/L的LB固體培養基上可緩慢生長，表現出顯著的耐鹽特性(表4)。

2.5.2 耐低溫性 低溫適生測定結果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99培養在14 ℃、18 ℃條件下，1 d后均長出菌圈；10 ℃低溫時，菌株WL911和WL99生長和擴展較快，培養3 d后即出現明顯的菌苔，菌株WL81和WL92培養第4天長出菌苔；4 ℃時，菌株WL911、WL92和WL99均可緩慢生長，培養第5天后出現少量菌苔，其余3株菌株不能生長。由此可見，菌株WL81、WL911、WL92和WL99具有良好的低溫適生性(表4)。

表4 4株芽孢桿菌菌株的耐鹽性及低溫適生性

2.6 芽孢桿菌的分子鑒定

2.6.1 16S rDNA序列鑒定 序列與GenBank中已知序列比對結果表明，菌株WL81與B.pumilusG10(登錄號：MK720406.1)的16S rDNA序列一致性為99%，菌株WL911與B.velezensisA2(登錄號：MG727659.1)的16S rDNA序列一致性為99%，菌株WL92與B.cereusLXJ11(登錄號：MN746202.1)的16S rDNA序列一致性為99%，菌株WL99與B.atrophaeusEGI61(登錄號：MN704536.1)的16S rDNA序列一致性為99%(表5)。構建的16S rDNA基因序列系統發育樹表明4株供試菌株與已知菌株具有明顯的親緣關系(圖5)。

圖5 基于16Sr DNA基因序列構建的系統進化樹

2.6.2gyrB基因序列鑒定 序列與GenBank中已知序列比對結果表明，菌株WL81與B.pumilusKYC18(登錄號：HM585081.1)的gyrB基因序列一致性為99 %，菌株WL911與B.velezensisJK-XZ8(登錄號：MK192100.1)的gyrB基因序列序列一致性為99%，菌株WL92與B.cereusWPySW2(登錄號：CP053289.1)的gyrB基因序列一致性為99 %，菌株WL99與B.atrophaeusTGRG7(登錄號：MT984377.1)的gyrB基因序列序列一致性為99%(表5)。構建的gyrB基因序列系統發育樹表明4株供試菌株與已知菌株具有明顯的親緣關系(圖6)。

圖6 基于gyrB基因序列構建的系統進化樹

表5 4株芽孢桿菌菌株的16S rDNA和gyrB序列比對結果表

綜合16S rDNA及gyrB分子鑒定結果，菌株WL81鑒定為短小芽孢桿菌B.pumilus，菌株WL911鑒定為貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis，菌株WL92鑒定為蠟樣芽孢桿菌B.cereus，菌株WL99鑒定為萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus。

3 討 論

高海拔地區的高寒草地長期受嚴寒、干旱等氣候的影響，加劇了草地退化、生態環境破壞、阻礙草地畜牧業的穩定發展[23]。紫花苜蓿作為栽培牧草，不僅可以提高退化草地恢復率，還可作為良好的粗飼料供家畜食用[24]。高原特殊的地理環境、氣候條件限制了紫花苜蓿的正常生長發育，同時，國內報道紫花苜蓿易受銳頂鐮孢(F.acuminatum)等侵染，導致其固氮能力下降，產量下降[25]。因此，若將能夠在極端環境中生存的高原本土芽孢桿菌應用到逆境條件下優良牧草的生產中，以期增強牧草抗性，促進牧草生長；同時，若將能夠降解纖維素的芽孢桿菌應用于飼料加工及秸稈還田，以提高養分轉化率，為高寒地區生態恢復和畜牧業發展提供有力基礎。

芽孢桿菌是有益微生物中一種重要的生防細菌，其生長過程中所產生的代謝產物伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等物質都對植物病原物具有抑制作用，可間接促進植物生長[26]。本研究測定4株菌株拮抗病原真菌活性，結果表明4株菌株對分離自小麥(T.aestivum)的禾谷鐮孢(F.graminearum)、分離自梭羅草(R.thoroldiana)的銳頂鐮孢(F.acuminatum)、分離自老鸛草(G.wilfordii)的鏈格孢(A.alternata)、分離自高山嵩草(K.pygmaea)的黑曲霉(As.niger)均表現出良好的拮抗活性。渠露露等[27]研究發現對水稻(Oryzasativa)幼苗接種類芽孢桿菌菌株ZLT11能明顯提高其生物量，還可增強水稻應對金屬Cd的脅迫抗性。本研究中將具有促生作用的芽孢桿菌菌株應用到紫花苜蓿的生長中，通過其生物量的增長探究菌株的促生能力，結果發現菌株WL911的促生效果最為突出，紫花苜蓿的平均株高、根長、鮮質量與對照相比，均有明顯增長。芽孢桿菌屬是一類自生固氮微生物，可為植物的生長發育提供必需的氮元素，牛鑫斌等[28]報道類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)菌株W-7和L-3的固氮酶活性高，具有提高植物產量和改善土壤質量的作用。本研究發現4個菌株均表現出良好的固氮能力，據此，將這些菌株應用到促進植物固氮中，對土壤氮素轉化及提高植物氮素養分具有重要意義。楊雪等[29]研究發現解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)菌株DGL1體內存在與降解纖維素相關的編碼基因CMCase，并通過KEGG數據庫(https://www.genome.jp/kegg/)注釋到與解纖維素有關的代謝途徑。本研究中4株芽孢桿菌菌株也均具有解纖維素活性，推測這些菌株體內也可能產生纖維素酶，對植物細胞壁具有一定的分解作用，其應用于牧草飼料加工、秸稈還田等方面，可提高養分吸收效率、秸稈利用率。潘晶等[30]研究認為芽孢桿菌在與植物互作的過程中，通過調節自身耐鹽基因的表達以多種作用方式提高植物的耐鹽性，促進植物的生長。本研究表明4株芽孢桿菌菌株也具有一定的耐鹽、低溫適生性，推測其體內可能具有耐鹽、耐低溫基因，對高原特殊環境具有一定的耐受力，可緩解逆境對植物造成的損害。

本研究中的4株芽孢桿菌菌株存在促進優質牧草紫花苜蓿生長，拮抗多種牧草病原真菌、固氮及降解纖維素活性及較強的抗逆性的潛力。一方面，通過抑制病原物對植物的侵害、間接促進植物生長；可定殖在植物根圍固定氮素、為其提供養分，促進植物生長；通過降解纖維素的方式，提高牧草適口性、促進草牧業發展。另一方面，對高原極端生境脅迫有更好的適應性。篩選優良生物學性狀的生防芽孢桿菌菌源對提高牧草抗病、加速牧草生長，飼草料加工生產等方面都具有極為重要的意義，為高原植被恢復、畜牧業持續發展提供基礎條件。

4 結 論

本研究發現白刺根圍的芽孢桿菌菌株WL81、WL911、WL92和WL99不僅具有顯著的促生作用，兼具有良好的生防功能及耐逆性。菌株WL911對紫花苜蓿幼苗生長具有顯著的促生效果，4株菌株均表現出良好的拮抗植物病原真菌活性，具有一定的固氮能力及降解纖維素活性，也具有一定的耐鹽、低溫適生性，是良好的高原環境微生物資源。