SNP-array技術在流產組織遺傳學分析中的價值

張衛云，王玉敏，李秀勤，李鳳啟

1. 周口市婦幼保健院（市兒童醫院）檢驗科（河南周口 466000）

2. 周口市兒科研究所（河南周口 466000）

稽留流產為臨床常見不良妊娠結局，可表現為胚胎停育且滯留女性宮腔內，嚴重影響母體健康，甚至危及女性生命安全[1]。研究表明14%流產由染色體異常導致，因此對流產絨毛組織進行染色體分析，有助于明確流產原因且為再次妊娠提供科學指導[2-3]。目前常采用熒光原位雜交技術進行檢測，可用于間期、中期核染色體檢測，對于檢測周期限制性較小，但是檢測過程中染色體分析、細胞培養等操作耗時較久，臨床應用時間利用率較低[4]。單核苷酸多態性微陣列（single nucleotide polymorphism microarrays，SNP-array）技術屬于新型、方便、高效、快速分子核型分析技術，通過芯片平臺可對DNA水平進行較好檢測[5]。近年來SNP-array技術在發育遲緩患兒遺傳學分析中應用廣泛，在單親二倍體、雜合性缺失方面檢測效果較好[6]。因此，SNP-array技術應用于流產組織遺傳學分析有望改善檢測結果。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2020年7月—2022年2月經周口市婦幼保健院確診為稽留流產的50例患者為研究對象。納入標準：①符合稽留流產診斷標準且孕周在7～12周[7]；②溝通、理解、智力正常且依從性較好的患者；③單胎妊娠且接受相關檢查。排除標準：①存在其他遺傳疾病的患者；②合并子宮肌瘤、惡性腫瘤、子宮內膜異位癥或其他影響胚胎著床疾病的患者；③由于男方原因導致流產的患者；④合并嚴重肝、腎、肺、心等功能異常的患者。本研究已獲所有患者及家屬知情同意。

1.2 檢測方法

SNP-array技術步驟主要包括：①預處理：無菌條件下將絨毛組織離心、重懸；②提取DNA：按照Invitrogen Ambion的RNA試劑盒提取絨毛組織DNA，計算純度、濃度；③雜交處理：按照Affymetrix Cytoscan 650K 芯片說明書進行純化、擴增、片段化、連接、標記、酶切、孵育、雜交、染色、洗滌等操作；④數據處理：利用Affymetrix Cytoscan 2500Dx系統及CHAS軟件對上述結果進行數據處理及分析。

熒光原位雜交技術檢測由專業檢驗醫師處理絨毛組織，具體步驟包括：①制片：剔除血塊、蛻膜等雜質后采用海斯迪克HKQS-209不銹鋼剪刀剪碎成絨毛枝，然后通過固定、消化等操作得到細胞懸浮液，最后進行滴片、固定、烘烤；②探針雜交：將玻片洗滌后給予消化、脫水、高溫變性、取出等操作，最后在42℃下給予特異性探針進行雜交；③檢測計數：由檢驗醫師利用熒光顯微鏡（Leica，DM2500 LED）進行細胞計數。

全部患者染色體突變致病性均采用Characterization of Germline variants（CharGer）軟件進行自動化解讀，根據 The American College of Medical（ACMG）指南對突變致病性進行評判，數據庫采用 Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）。

1.3 觀察指標及評價標準

染色體異常：檢測染色體異常數低于全部細胞計數的10%為陰性，提示樣本正常；染色體異常數高于全部細胞計數的60%為陽性，提示樣本異常；染色體異常介于全部細胞計數的10%～60%之間為嵌合體。

1.4 統計學分析

計量資料采用均數和標準差（±s）表示，采用t檢驗分析；計數資料采用例數和百分比（n，%）表示，利用卡方檢驗分析。本研究采用SPSS 25.0軟件進行分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

研究共納入50例患者，平均年齡為（36.25±4.17）歲，平均體重為（53.79±4.20）kg，以中專或高中學歷為主（58%），患者的一般資料，詳見表1。

表1 患者一般資料Table 1. Basic information of included patients

2.2 染色體異常檢出情況對比

SNP-array組染色體異常34例，其中整倍體異常22例，非整倍體異常12例；對照組中染色體異常24例，其中整倍體異常15例，非整倍體異常9例。SNP-array組染色體異常檢出率為68.00%，高于對照組48.00%（χ2=4.105，P=0.043）。見表2。

表2 兩組染色體異常檢出情況對比Table 2. Comparison of detection of chromosome abnormalities between two groups

2.3 SNP-array組染色體微重復微缺失具體情況

SNP-array技術分析按樣本納入順序進行編號，其中染色體微重復微缺失9例，3例致病性不明確。33號為單一位點重復，7號為單一位點缺失，2號為兩位點重復，41號為兩位點缺失，其余5個均為2個位點及以上微重復微缺失，詳見表3。

表3 SNP-array組染色體微重復微缺失具體情況（n，%）Table 3. Details of chromosome micro-replication and microdeletion in SNP-array group (n, %)

2.4 染色體非整倍體異常檢出情況對比

SNP-array組非整倍體異常檢出例數多于對照組，其中45、X染色體異常檢出3例，16-三體異常檢出2例，18-三體異常檢出1例，詳見表4。

表4 兩組染色體非整倍體異常檢出情況對比（n，%）Table 4. Comparison of abnormal detection of chromosome aneuploidy between two groups（n, %）

3 討論

稽留流產患者胚胎不能排出體外，滯留宮腔，嚴重影響女性患者生命健康與生活質量，還可導致緊張、焦慮、抑郁、恐慌等負性情緒[8]。引起稽留流產因素可包括內分泌、免疫、環境、父體、母體及遺傳等情況，其中染色體異常屬于常見病因[9]。目前常采用熒光原位雜交技術進行檢測，明確病因并為下次妊娠提供科學指導，但熒光原位雜交技術檢測范圍有限，部分染色體不能覆蓋，對于稽留流產病因檢出效果欠佳[10]。SNP-array技術著重檢測DNA CNVs，通過芯片識別染色體重排情況，同時有利于檢出染色體存在的不平衡情況，明確基因組變異情況及變異數，應用于流產組織分析可有望改善異常染色體檢出率[11]。

研究結果顯示，SNP-array技術對染色體異常檢出率為68.00%，高于對照組48.00%。說明相比于傳統熒光原位雜交，SNP-array技術對流產組織染色體異常檢出率較好。因傳統熒光雜交檢測法不能有效檢測整個染色體組，檢測范圍局限于22、21、16、13、18染色體，其他倒位、重復、缺失、易位檢測效果也較差[12]。SNP-array技術可檢測所有染色體的丟失與獲得，利用芯片及數據庫識別染色體排列情況，最終得出致病、可能致病、不明確、可能良性、良性五種結果[13]。SNP-array技術對染色體的全覆蓋對于染色體異常檢測優勢明顯，有助于改善流產組織染色體異常檢出率。本研究結果與謝曉蕊研究結果一致，SNP-array對流產絨毛染色體變異異常檢出率較高[14]。

對照組中染色體異常24例，其中整倍體異常15例，非整倍體異常9例；SNP-array組中染色體異常34例，其中整倍體異常22例，非整倍體異常12例。說明SNP-array技術對于兩種染色體異常均可檢出，且相比于傳統方法優勢明顯。原因在于SNP-array技術通過監測DNA到了拷貝數變異檢測染色體重復及微缺失，檢測過程中充分考慮拷貝數變異的多態性特征。朱麗芬等研究也表明SNP-array技術對于非整倍體異常檢測效果良好[15]。SNP-array技術結合DECIPHER、DGV等多個數據庫對結果進行分析，數據充分且結果可靠，對于非整倍體異常檢測效果較好[16]。傳統檢測手段對于倒位攜帶、平衡易位等情況檢測效果較差，且對于絨毛染色體顯帶效果欠佳，分辨率較低，而SNP-array技術分辨率可達到1Mb，可有效確定重復片段斷裂情況及染色體缺失情況。

SNP-array組中有3例致病性不明確。一方面由于研究過程中突變結果解讀為自動化解讀，因此存在數據庫資源豐度不足導致部分致病情況分析欠佳的情況；另一方面可能是由于檢測來源為母親單方，需要增加父親染色體檢測得出最終結果。

綜上，SNP-array技術在流產組織遺傳學分析中對異常染色體檢出率較高，具有較好的臨床意義，有望廣泛應用。