三七皂苷R1對血管平滑肌細胞遷移及p38 MAPK蛋白的影響*

蔡 婷 潘力弢 李蔣鳳 譚 亮 張 夢 李晶晶 樊光輝，3△

（1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061；2.廣東省深圳市第二人民醫院，廣東 深圳 518055；3.深圳大學附屬華南醫院，廣東 深圳 518111）

動脈粥樣硬化是導致急性心腦血管危重癥的重要因素，嚴重威脅人類生命健康［1］。血管平滑肌細胞（VSMC）是血管中膜的主要細胞成分，在動脈粥樣硬化的形成中起重要作用［2］。當血管內皮細胞受到損傷時，血管釋放炎性細胞因子和生長因子，誘導VSMC遷移、增殖和分化，導致內膜增厚、斑塊形成和管腔狹窄［2-4］。三七是臨床常用的傳統中藥，具有活血化瘀、消腫鎮痛、強壯補虛等功效。三七皂苷R1（Notoginsenoside R1）是三七提取物中有效活性成分之一，具有減輕炎癥、修復內皮細胞障礙等作用，可減輕動脈粥樣硬化的進展［5-7］，然而，三七皂苷R1對VSMC遷移的影響尚不清楚。本研究觀察了三七皂苷R1對VSMC遷移的影響并初步探討了其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人源VSMC（貨號：MZ-1186）購自寧波明舟生物科技有限公司。用DMEM完全培養基在37℃、5%CO2環境下培養，DMEM完全培養基含有10%FBS、1%雙抗生素（青霉素/鏈霉素）、10 mmol/L HEPES和10 mmol/L TES。

1.2 試藥與儀器 三七皂苷R1（上海源葉生物技術有限公司，貨號：B21099），純度≥98%。AngⅡ（Med Chem Express公司，貨號：HY-13948）。DMEM培養基（貨號：11965118）和胎牛血清（貨號：10100147）購自Thermo Fisher Scientific公司。兔抗鼠MMP2（貨號：ab92536）、MMP9（貨號：ab76003）、phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（貨號：ab4822）和 GAPDH（貨號：ab181602）均購自Abcam公司，兔抗鼠p38 MAPK（碧云天生物技術有限公司，貨號：AF7668）。鼠抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG抗體（Santa Cruz公司，貨號：sc-2357）。倒置顯微鏡（Olympus公司，型號：BX43）。

1.3 分組與干預 取對數生長期細胞，制備細胞懸液，調節細胞密度為1×105/mL，均勻接種于6孔板中。參照課題組前期實驗及相關文獻選用1 μmol/L的AngⅡ誘導VSMC遷移，建立細胞遷移模型［8-10］。將發生遷移的VSMC隨機分組，用不同濃度（5、10、20 μmol/L）的三七皂苷R1干預48 h，分別記為三七皂苷R1低、中、高劑量組，未用藥物處理的則為對照組。

1.4 細胞劃痕實驗 當細胞處于峰-谷生長狀態時，用10 μL的無菌槍頭在每個6孔板中劃上3～5條平行橫線。無菌PBS清洗以除去不黏附的細胞，隨后按照各實驗組的要求處理細胞并培養48 h。用4%多聚甲醛固定細胞15 min，按照結晶紫染色步驟進行染色，用倒置顯微鏡觀察細胞傷口愈合情況。用Image J軟件計算各實驗組的相對遷移面積。

1.5 蛋白質印跡實驗 按照各實驗組的要求處理細胞并培養48 h。用含有蛋白酶的RIPA裂解緩沖液在冰上裂解VSMC細胞收集總蛋白質。總蛋白質經BCA定量后，每孔上樣20 μg，用10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液在25℃下孵育膜1 h。然后用TBST洗滌膜，并與相應的抗體（1∶1 000稀釋）在4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，然后與HRP結合的二抗溶液（1∶5 000稀釋液）在25℃孵育1 h，TBST洗滌，曝光、顯影，用ImageJ軟件對蛋白質條帶進行定量分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（）表示。組間差異比較采用單因素方差分析，然后采用LSD法進行檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組VSMC遷移面積的比較 見表1。三七皂苷R1對AngⅡ誘導的VSMC遷移有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比有顯著差異，見圖1。進一步用Image J軟件分析各組細胞遷移面積，與對照組相比，三七皂苷R1低、中、高劑量組能顯著減少VSMC遷移面積，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與低劑量組相比，中劑量組減少VSMC遷移面積不明顯，但高劑量組能顯著減少VSMC遷移面積，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組VSMC相對遷移面積比較（±s）

表1 各組VSMC相對遷移面積比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與三七皂苷R1低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 相對遷移面積（%）對照組三七皂苷R1低劑量組三七皂苷R1中劑量組三七皂苷R1高劑量組100.00±3.92 80.35±4.36*67.60±5.23*46.83±6.66**△

圖1 各組VSMC遷移情況（結晶紫染色，40倍）

2.2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表達的比較 見表2。三七皂苷R1使MMP2、MMP9和P-p38 MAPK蛋白表達減少，且與三七皂苷R1劑量呈負相關，p38 MAPK蛋白在各組中沒有變化，見圖2。用Image J分析蛋白條帶灰度值，與對照組相比，三七皂苷R1中劑量組和三七皂苷R1高劑量組的MMP2和MMP9蛋白條帶相對灰度值明顯減少，有顯著差異（P＜0.05）；p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值在各組中沒有任何變化（P＞0.05），但P-p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值隨著三七皂苷R1劑量增加而減少，中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與低劑量組比較，中、高劑量組的MMP2和MMP9蛋白條帶相對灰度值明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值各組均無變化；中劑量組的P-p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值減少，但差異不明顯；高劑量組的P-p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK蛋白表達

表2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表達比較（%，±s）

表2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表達比較（%，±s）

注：MMP2、MMP9和p38 MAPK數值均是其條帶灰度值相對內參GAPDH條帶灰度值的百分比值；P-p38 MAPK數值是其相對p38 MAPK條帶灰度值的百分比值。

組別MMP2MMP9p38 MAPK P-p38 MAPK對照組三七皂苷R1低劑量組三七皂苷R1中劑量組三七皂苷R1高劑量組126.56±3.74 107.93±3.07 61.60±2.15**△53.67±2.04**△△117.17±3.46 106.37±3.03 50.70±1.77**△△33.31±1.27**△△132.18±4.17 134.92±2.12 136.36±2.83 134.99±1.09 95.72±3.18 77.68±2.21 51.18±2.62*47.60±2.48**△△

3 討 論

動脈粥樣硬化是急性心腦血管疾病的病理基礎，也是急性心腦血管事件發生的重要危險因素。動脈粥樣硬化是現代醫學名，中醫學中并無其記載，但根據其致病特點和臨床表現，可將其歸屬于“瘀證”“痰證”“脈痹”等范疇［11］，其累及的臟腑多為肝脾腎三臟，脾失運化，肝不條達，腎氣化失常，故津液輸布異常，聚液為痰，痰濁壅塞脈道，脈道不暢，氣血運行無力，導致血液凝滯，瘀血生成，痰濁與瘀血相互膠著，故脈道狹窄閉塞導致了一系列疾病。故痰濁、瘀血是動脈粥樣硬化發生與發展的關鍵，痰瘀互結、損傷脈道是動脈粥樣硬化的重要病機［12-13］。

中藥三七歸肝、胃經，性溫，味辛，具有活血化瘀、消腫定痛等功效。三七皂苷R1是從三七中提取的單體皂苷，具有保護心臟、改善缺血-再灌注血管損傷、抑制炎癥、抗動脈粥樣硬化等作用［14-17］，然而，其在抑制VSMC遷移中的作用尚不清楚。本實驗以三七皂苷R1低、中、高3種劑量干預遷移的VSMC細胞，與對照組比較發現，三七皂苷R1低、中、高劑量組能顯著減少VSMC遷移面積，且與三七皂苷R1的劑量相關，說明三七皂苷R1對AngⅡ誘導的VSMC遷移有抑制作用，且這種抑制作用隨三七皂苷R1劑量的增加而增強。另外，基質金屬蛋白酶（MMPs）在細胞遷移中起重要作用，是動脈粥樣硬化斑塊不穩定的生物標志物，其升高與動脈粥樣硬化導致的急性危重型心血管事件的發生風險呈正相關［18-19］。在本實驗中，與對照組比較，三七皂苷R1可抑制MMP2和MMP9的表達，且呈劑量依賴性。因此，三七皂苷R1具有抑制VSMC遷移從而阻止動脈粥樣硬化發展的潛力，然而其分子機制尚不明確，還有待進一步探討。p38 MAPK的活化與細胞遷移活動有關［20］，本研究發現，與對照組比較，三七皂苷R1可降低磷酸化p38 MAPK蛋白的水平且與劑量相關，這說明三七皂苷R1抑制VSMC遷移可能與降低磷酸化p38 MAPK有關。

綜上所述，本研究提示三七皂苷R1抑制了AngⅡ誘導的VSMC遷移面積，同時下調MMP2和MMP9遷移蛋白，且呈劑量依賴性，其機制可能與降低p38 MAPK蛋白磷酸化有關，這些結果為三七皂苷R1靶向治療動脈粥樣硬化提供了新的治療思路。