天香丹對動脈粥樣硬化模型小鼠TLR4/NF-κB信號通路的影響*

張 華 苗文艷 徐正偉 葉成輝 安冬青，3△

（1.新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州中醫醫院，新疆 昌吉 831100；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆名醫名方與特色方劑學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830000）

動脈粥樣硬化性心血管疾病（CVD）已成為全球人口死亡的首要原因，炎癥反應貫穿了動脈粥樣硬化（AS）發生發展的始終［1-3］。研究表明，當組織受損時，可誘導免疫反應從而激活Toll樣受體-4（TLR4），引起核因子-κB（NF-κB）磷酸化，介導下游因子發生炎癥反應、導致內皮功能障礙，最終導引發AS［4-6］。目前針對CVD的治療，即使是降血脂、抗血小板與控制血壓的藥物也只能降低部分CVD事件發生的風險［7-9］，且存在一定的副作用，所以仍缺乏積極有效的防治措施。AS的發生多由內外之邪引發臟腑功能失調、氣血津液運行障礙導致，治療可運用清熱解毒且氣味芳香、性善走竄之品清解“內外之毒”。天香丹是名老中醫張絢邦教授以通補開泄法為理論總結而成的經驗方，該方以新塔花為君，紅景天、丹參為臣，佐以降香4味中藥按特定比例組成，有化痰散結、益氣補虛、和血通絡的作用，可用于防治AS性心血管疾病。臨床研究表明，其在調節血脂代謝、保護內皮細胞、抑制炎癥反應等方面療效確切，但防治AS機制尚需進一步研究［10-14］。本研究通過建立AS小鼠模型進行藥物干預，后期進行病理學實驗、分子生物學實驗觀察TLR4/NF-κB通路下游相關炎癥因子、血脂水平指標、血管病理性變化等，旨在為中醫藥防治AS性心血管病、開發新的中醫藥資源提供科學依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠 30只，普通C57BL/6J小鼠10只，平均體質量（18.00±2.00）g，均由北京維通利華公司購入，許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養于新疆醫科大學醫學動物實驗中心SPF環境，并通過倫理委員會審批，編號：MEC-20210214-001。

1.2 試藥與儀器 阿托伐他汀（北京Solarbio公司，批號：20151223）；天香丹（新疆醫科大學第四臨床醫院，批準號：新藥制字ZO4000820）。高脂飼料（成分：基礎飼料82.68%、豬油10%、豬膽鹽0.2%、膽固醇2%、蔗糖5%、丙硫氧基嘧啶0.12%），由新疆醫科大學動物中心加工而成。小鼠TLR4 ELISA試劑盒（美國EBioscience）、小鼠NF-κB ELISA試劑盒（美國EBioscience公司）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（美國EBioscience）、HE染色試劑盒（G1120，北京Solarbio）等。PM-401石蠟熔蠟箱（日本SAKURA）；5235組織包埋機（日本SAKURA）；LKB-V切片機（瑞典LKB）；低溫高速離心機（德國Eppendrof）；DM 2500光學顯微鏡（德國LEIC）；Type 1500多功能酶標儀（美國Thermo）等。

1.3 造模與分組 所有小鼠于SPF級環境適應性喂養1周后，高脂飼料繼續喂養8周建立動脈粥樣硬化模型。以ApoE-/-小鼠為標準，肉眼觀察見小鼠反應遲鈍，精神倦怠，皮毛干枯無光澤且稀疏，體質量增加明顯。病理學實驗，鏡下觀察見小鼠主動脈內膜纖維性增厚鈣化，管腔狹窄明顯，平滑肌細胞排列紊亂，有脂質沉積，出現膽固醇結晶或粥樣斑塊等。以上證實AS模型制備成功。造模成功后，將C57BL/6J小鼠設為空白對照組，ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、他汀組和天香丹組，每組10只。

1.4 給藥方法 根據成人臨床常用量等效換算［15］，小鼠實驗用藥量=9.1×成人臨床常藥量［g（/kg·d）］。將藥物溶于0.5 mL蒸餾水（小鼠最大灌胃劑量0.4 mL/10 g）灌胃，每日1次，每周根據體質量變化調整劑量。他汀組灌胃阿托伐他汀藥液3 mg（/kg·d）、天香丹組灌胃天香丹藥液2.7 g（/kg·d），模型組和空白組灌胃0.5 mL蒸餾水，持續12周。所有小鼠SPF環境喂養，不限飲食飲水，活動自由。

1.5 標本采集與檢測 第12周末，禁食不禁水12 h，小鼠麻醉后眼球取血至EP管內，7 500 r/min離心15 min取上清，-80℃冰箱保存；無菌條件下迅速打開胸腹腔，取胸腹主動脈置于4%多聚甲醛中固定。1）血脂檢測。自動生化儀測量血清CHO、三酰甘油（TAG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。AS指數（AI）=（CHO-HDL）/HDL。2）HE染色和斑塊面積分析。取甲醛固定的主動脈依次經過組織包埋、固定、脫水、切片、染色、拍照等步驟，利用圖像分析軟件測量陽性面積，計算主動脈斑塊面積（PA）/管腔面積（LA）值，觀察病變部位及形態學變化。3）ELISA法測血清中TLR4、NF-κB、TNF-α含量，試劑盒測定各組小鼠血清中細胞因子TLR4、NF-κB、TNF-α表達水平，以酶標儀450 nm波長為條件，計算出相應因子的濃度值。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD法，方差不齊采用非參數檢驗（Tamhane's T2）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量和一般情況比較 見表1。灌胃第12周末，空白組小鼠對外界刺激反應靈敏，暴躁好斗，皮毛干凈，飲食飲水及二便正常，體質量增加不顯著。模型組小鼠對外界刺激反應遲鈍，喜靜少動，皮毛干枯無澤且脫落，飲食飲水較模型組降低，體質量較空白組增加明顯（P＜0.01）。與模型組比較，他汀組、天香丹組小鼠均表現喜靜少動，皮毛干枯有脫落，飲食飲水減少，體質量增加緩慢，差異有統計學意義（P＜0.01）。他汀組與天香丹組小鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠體質量變化比較（g，±s）

表1 各組小鼠體質量變化比較（g，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10初始體質量18.02±1.13 18.01±2.05 18.10±3.30 18.06±0.92灌胃第2周19.26±0.35 21.41±0.57*20.06±1.12 20.52±1.26灌胃第6周24.24±1.17 28.11±2.10*25.06±1.20△△26.31±1.51△△灌胃第12周27.22±1.31 35.65±2.35*29.34±1.15△△30.22±1.35△△

2.2 各組小鼠血清血脂水平比較 見表2。與空白組比較，模型組TAG、TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，他汀組、天香丹組TAG及TC降低明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），天香丹組HDL-C升高，LDL-C降低，差異有統計學意義（P＜0.01），他汀組HDL-C和LDLC變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。他汀組與天香丹組小鼠血脂水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清血脂水平比較（mmol/L，±s）

表2 各組小鼠血清血脂水平比較（mmol/L，±s）

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10 TAG 0.64±0.01 1.34±0.07*0.97±0.08△△0.85±0.15△△TC 2.75±0.04 15.32±1.01*13.53±2.86△△9.81±0.08△△HDL-C 2.17±0.10 0.62±0.01*0.63±0.08 0.99±0.07△△LDL-C 0.36±0.06 5.84±0.94*6.04±0.19 3.86±0.33△△

2.3 各組小鼠主動脈形態學變化 見圖1、表3。所有小鼠均見AS的形成，管腔出現不同程度的狹窄。空白組小鼠主動脈壁未見明顯平滑肌細胞增生，未見膽固醇結晶形成，少量狹窄。模型組斑塊增多，主動脈壁厚度明顯不均勻，局部發生鈣化，外膜可見大量炎性細胞浸潤及斑塊形成，PA/LA比值顯著大于空白組（P＜0.01）。他汀組、天香丹組主動脈管壁厚度不均勻，內膜增厚，但小于模型組，外膜內可見少量炎性細胞浸潤，病理改變較模型組輕，兩組PA/LA比值均小于模型組（P＜0.01）。他汀組與天香丹組PA/LA比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠主動脈病理觀察（HE染色，200倍）

表3 各組小鼠主動脈PA/LA值比較（±s）

表3 各組小鼠主動脈PA/LA值比較（±s）

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10 PA/LA（%）0.12±0.04 0.67±0.19*0.23±0.15△△0.25±0.10△△

2.4 各組小鼠血清細胞因子TLR4、NF-κB、TNF-α水平比較 見表4。模型組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α含量較空白組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比，他汀組、天香丹組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α含量均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。他汀組與天香丹組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α含量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組小鼠血清TLR4、NF-κB、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組他汀組天香丹組n 10 10 10 10 TLR4 1.04±0.38 7.54±1.76*2.05±0.57△△3.90±0.76△NF-κB 1.07±0.16 5.93±1.70*1.79±0.63△△2.01±0.71△△TNF-α 706.65±100.17 1 655.54±258.98*1 219.68±150.87△△1 248.46±149.83△△

3 討 論

中醫根據AS臨床癥狀將其歸屬于“胸痹”“真心痛”“脈痹”“中風”等范疇。名老中醫張絢邦教授認為，該病病機為本虛標實，本虛為心肝之血、肺脾腎精元之氣不足，標實為氣滯血瘀痰阻，治當以通補開泄為法。天香丹為通補開泄法代表方，口服療效較好，臨床運用三十余年，在抗AS、改善心肌缺血等方面具有良好療效。

國內外對于TLR4/NF-κB信號通路的報道很多。NF-κB是一種特殊蛋白，它首先成熟在B細胞和漿細胞中，并廣泛存在于人體組織細胞中。在AS病變過程中，其主要特征是血管壁發生炎癥反應。越來越多的研究表明［16-17］，TLR4在CVD的最初發展中起著重要作用，即使在斑塊不穩定及破裂過程中亦是如此，其介導的TLR4/NF-κB信號通路已成了治療CVD的新靶點。當出現組織受損時，TLR4通路被活化，從而激活NF-κB，釋放大量的炎癥因子，出現內皮功能障礙、炎癥、血管壁變薄等，增加不穩定性因素，引起斑塊的破裂和血栓形成，導致心血管病事件發生［18-19］。課題組前期研究表明［12-14］，天香丹能夠有效緩解心絞痛的發作，調節血脂水平，以及提高患者血清內皮生長因子含量，保護內皮細胞受損，刺激內皮細胞增殖。

本研究結果顯示，通過高脂飼料喂養可成功建立AS小鼠模型，而天香丹組小鼠體質量較模型組偏低，血脂有所改善（P＜0.01），主動脈炎性浸潤及脂質沉淀減少，血管內皮病理情況有所緩解，且未見明顯斑塊形成，天香丹組主動脈PA/LA比值小于模型組（P＜0.01），提示天香丹能夠降低AS小鼠體質量、調節血脂，改善內皮功能，減輕炎癥反應。本研究還發現，血清中TLR4、NF-κB、TNF-α含量均低于模型組，與阿托伐他汀組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），這提示天香丹可能是通過降低TLR4/NF-κB信號通路內蛋白水平，介導下游細胞因子，最終達到抑制炎癥反應，防治AS的作用。

總之，本研究基于炎癥角度探討了天香丹防治AS的機制，對今后中醫藥抗AS尋找新的靶點進行了探索，認為其抗AS效果可能與調控TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應有關，但并不能確定天香丹抑制炎癥為其防治AS的唯一途徑。天香丹內具體哪些成分起到了靶向作用，還需對藥效學和機制展開深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。