香豆素類化合物結構修飾合成及抑菌活性測定

高冬梅，杜振亭

(1.楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 化學與藥學院，陜西 楊凌 712100)

香豆素類化合物具有α-苯并吡喃酮結構[1]，廣泛存存在于植物、動物、微生物及其次生代謝物中。目前已分離得到的1300多種香豆素類化合物及其衍生物，根據環上取代基種類及位置不同，將香豆素類化合物分為簡單香豆素、吡喃香豆素、呋喃香豆素及其他香豆素[2]4大類。

由于香豆素類化合物苯并吡喃環共軛體系及特殊取代基的存在，使該類化合物具有豐富的結構和多樣的用途，如抗凝血[3-5]、抗菌[6-7]、抗腫瘤[8-9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、殺蟲[13-14]等生物活性，還可作為熒光增白劑、熒光燃料[15]、檢測陰陽離子[16-17]和中性分子[18]的生物熒光探針等材料使用。雖然香豆素類化合物用途廣泛，但是從植物中提取該類化合物，產量低，分離難度大等缺陷極大的限制了其大規模開發與利用，因此，對該類化合物結構修飾與化學合成方法的研究受到極大的關注。目前應用最廣泛的香豆素衍生物制備方法是Knoevenagel縮合反應[19]、Wittig反應[18]、Claisen重排反應、Heck反應、Pechmann縮合反應[20]。除此之外,還出現了一些合成香豆素衍生物的新型反應,如無溶劑有機反應、光催化反應、微波輔助反應等。

本文借助合成手段將香豆素母核與新穎模式酰胺基團通過活性亞結構拼接途徑連接，得到一系列香豆素衍生物并評價其抑菌活性，旨在尋找結構優良、高效、環保的抑菌劑先導化合物并通過探索其構效關系為后續化合物的設計與合成奠定理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCEШ 核磁共振儀(德國Bruker公司，500 MHz)；DFY-5/80低溫恒溫反應浴(鄭州凱鵬實驗儀器有限公司)；BC-R206旋轉蒸發儀(上海貝凱生物化工設備有限公司)；IKA C-MAG HS7磁力攪拌器(德國IKA公司)；SB25-12DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；MP420全自動視頻熔點儀(濟南海能儀器股份有限公司vasinfectum)；WFH-203三用紫外分析儀(上海精密科學儀器有限公司)。

取代水楊醛、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽均為市售分析純；無水乙醇、冰乙酸、乙酰乙酸乙酯、哌啶、丙酮、甲苯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等為天津博迪化工分析純試劑。

1.2 目標化合物合成

系列目標化合物以取代水楊醛和丙二酸二乙酯為原料，首先得到中間體1(3-甲酸乙酯-香豆素衍生物)，然后進行酯的堿性水解反應酸化得到反應中間體2(3-甲酸-香豆素衍生物)，在此基礎上使用羧酸酰基化催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)催化活化，進行一系列酰基化取代獲得a(a1～a9)、b(b1～b9)、c(c1～c2)、d(d1～d3)、e(e1～e3)5類共26個目標化合物。目標化合物合成路線如圖1所示；系列目標化合物結構如表1所示。

圖1 目標化合物合成路線Fig.1 The synthetic route of the target compound

中間產物1的合成：在50 mL圓底燒瓶中分別加入丙二酸二乙酯(3.4 mL)，各類取代水楊醛(2.1 mL)、六氫吡啶(哌啶0.3 mL)、無水乙醇(15 mL)、冰醋酸(0.5 mL)，磁力攪拌下加熱回流2 h，然后放置至室溫(薄層色譜TLC全程跟蹤實驗反應進程)，溫度降低后加入20 mL水，后冰浴冷卻1 h，待結晶后，減壓抽濾，無水乙醇洗滌2～3次，得到白色晶體(熔點90-93 ℃)。

表1 目標化合物結構Tab.1 Structure of the target compound

中間產物 2的合成：將中間產物1(2 g)置入50 mL圓底燒瓶中，依次分別加入NaOH(1.5 g)、體積分數95%乙醇(10 mL)、水(5 mL)，在溫度65 ℃條件下磁力攪拌加熱回流1 h，放置降溫至室溫(薄層色譜TLC全程跟蹤實驗反應進程)；然后轉入燒杯中，加入5 mL濃鹽酸、25 mL水，冰浴加速結晶，后抽濾，用冰水洗滌2次干燥即可(熔點188 ℃)。

目標化合物3的合成：將中間產物2(2 g)加入50 mL圓底燒瓶中，依次分別加入DMAP(0.1 g)、EDC(0.1 g)，各類苯胺(4 g)，溶劑DMF25 mL，磁力攪拌下在溫度85 ℃加熱回流2.5 h，靜置至室溫(薄層色譜TLC全程跟蹤實驗反應進程)，然后將反應體系一同轉入大燒杯中，加入水50 mL水洗滌2～3次后減壓抽濾，干燥后，采用硅膠柱層析、重結晶等方法分離純化得到系列目標化合物。

1.3 抑菌活性測定

以氨芐青霉素為陽性對照，氯仿為陰性對照，采用濾紙片法測試供試化合物對蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)8種供試病原菌的抑菌活性。將供試化合物配制成質量濃度為100 μg/mL 的氯仿溶液，待牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基等高壓滅菌處理后，采用涂布平板法將菌種均勻涂在培養基表面；然后將含有待測藥液的濾紙片(6 mm)完全貼合于帶菌培養基上，一個化合物設置3組重復，一個陽性對照和陰性對照。待處理完成后將培養基轉移至溫度37 ℃培養箱中培養9～12 h，觀察各濾紙片透明程度，采用十字交叉法測定抑菌圈大小，篩選出活性較好的化合物后，進一步測定其最小抑菌濃度MIC值。

2 結果與討論

2.1 目標化合物物態與產率

按照圖1 合成路線，合成出的a(a1～a9)、b(b1～b9)、c(c1～c2)、d(d1～d3)、e(e1～e3)5類26個目標化合物，其物態、產率結果如表2所示。

表2 目標化合物物態與產率Tab.2 State and yield of target compound

2.2 抑菌活性

目標化合物抑菌活性測定結果表明，在質量濃度為100 μg/mL條件下，該類型化合物對蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌抑制活性不佳；不同結構類型化合物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、煙草青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌的抑制活性差異較大，c類化合物對這幾種供試菌無抑制活性，d、e類化合物抑制活性優于a類化合物，d2、e2化合物的抑菌效果甚至接近陽性對照組；較多化合物a3、a4、a5、a6、d1、d2、d3、e1、e2、e3對枯草芽孢桿菌具有廣譜抑菌性。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)

根據目標化合物抑菌活性測試結果，篩選出部分抑菌活性較好的化合物，測定其最小抑菌濃度(MIC)值。表1中化合物d1、d2、d3、e1、e2、e3對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、煙草青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌有廣譜抑菌效果且對枯草芽孢桿菌的MIC值低于50 μg/mL，表明抑制效果良好。表1中化合物d1對大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果優于煙草青枯病菌和獼猴桃潰瘍病菌；化合物e1對大腸埃希氏菌和獼猴桃潰瘍病菌的活性相對于枯草芽孢桿菌和煙草青枯病菌較弱。

3 結語

(1)本文通過簡便、快捷的方法合成了香豆素類衍生物26個，其中多數為文獻未報到的新化合物，并采用核磁、紅外等方法對其結構進行表征確認。所采用的合成方法路線便捷、產率高，為該類化合物的合成研究提供了參考；

(2)以氨芐青霉素為對照，測試26個目標化合物對枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、煙草青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌、蠟狀芽孢桿等8種供試病原菌的活性，以及部分抑菌活性較好化合物的MIC值，發現目標化合物結構中供電子基團所在的位置不同，其抑菌活性差別較大，該結論為香豆素類化合物結構修飾合成研究提供了理論基礎。