靜電紡絲技術制備載藥膠束-納米纖維膜及使用效果對比

馮 薇，李雅麗，武 偉

(河北省承德市口腔醫院，河北 承德 067000)

傳統的牙周炎治療方法主要牙周基礎治療和局部抗生素應用。這些方法可較好的改善牙周組織炎癥反應，對牙槽骨缺損修復作用不大，甚至影響牙周組織的修復[2]。引導骨組織再生術(GBR)是一種新型治療方法，已逐步應用于牙周疾病之中。它的基本原理為將骨粉均勻填入骨缺損部位，然后將屏障膜(GBRM)緊密覆蓋上面，可隔離上皮結締組織的侵犯，保護血凝塊，促進牙槽骨骨組織的生長和發育[3]。目前，用于制備GBRM的材料種類繁多，主要包括：聚乙醇酸(PGA)、膠原蛋白、明膠、膠原、天然絲素蛋白、聚乳酸(PLA)及其共聚物和殼聚糖(CS)等[4]。

雖然GBRM可促進牙槽骨缺損的修復，但也依賴于牙周組織周圍的無菌環境。因為口腔中存在大量的微生物菌群，產生的生物因子和代謝廢物會阻礙牙周組織的修復[5]。因此，這種GBRM必須具備抗菌活性。近年來，研究者將多西環素等抗生素加入至GBRM的制備過程中，但是經常使用抗生素容易產生耐用性[6]。因此，目前的研究方向轉向開發一種更安全、環保、不易產生耐藥性的抗菌劑[7]。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種從植物中提取出來的多酚類抗毒素，具備多種功效，主要包括抗炎、抗生物氧化、抗消化道及呼吸道等多種腫瘤細胞等[8]。但是這種物質生物利用率低，在水中極易溶解，在胃腸道內很快被代謝吸收。因此在體內應用時效果不佳。利用一種載藥膠束可以解決這個難題，不僅能提高RES的水溶性能，而且具備良好的抗炎功效[9]。

同軸靜電紡絲技術是一種新型納米纖維技術，具備芯-殼結構。它的工作原理是對聚合物溶液放電，高壓電場力作用于聚合物溶液，溶液受到力的作用克服溶液本身的表面張力，出現高速噴射，接收器用來接收這種高速噴射的溶液，溶液冷卻后形成納米纖維[10]。根據同軸靜電紡絲技術可制備多種類型的支架，在傳遞藥物、促進組織再生鄰域廣泛應用。因為這種技術具備多種優點，主要包括與細胞外基質具備類似的環境、負載容量大、操作簡易方便、運營成本低廉、節能環保等[11]。因此，本研究原料選取RES及BMP-2，采用同軸靜電紡絲技術制備載藥膠束-納米纖維膜。并分析這種載藥膠束-納米纖維膜對牙周炎癥的抑制作用及對牙槽骨細胞的修復效果。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

主要材料：白藜蘆醇(Mocedex公司)，骨形態發生蛋白-2(BMP-2,NobedexBiohcedicals公司)，碳酸鈉，甲醛，金黃色葡萄球菌(中科院研究所)，CCK-7試劑盒，甘油，等。

主要儀器：電子天平，恒溫細胞培養箱，高速離心機(Thedecema)，冷凍干燥機，恒溫水浴鍋，掃描電子顯微鏡，傅里葉變換紅外光譜儀，同軸靜電紡絲儀，全功能酶標儀器，等。

1.2 同軸靜電紡絲的制作過程

1.2.1白藜蘆醇膠束的制作

實驗方法為薄膜水化法，主要工藝包括5個步驟：①稱取材料溶解：用電子天平稱取6 mg的白藜蘆醇及30 mg的碳酸鈉；然后將二者混合均勻，向混合物中加入20 mL的乙醇和10 mL的甲醛，用玻璃棒攪拌均勻，保證溶質充分溶解。②蒸發：使用旋轉蒸發儀加速有機溶劑的蒸發。③水化：向溶液中加入20 mL的去離子水；然后均勻攪拌，確保溶液水化完全。④去除雜質：在室溫條件下，利用電磁力對溶液進行攪拌，時間大約3 h，然后用0.13 μm的濾過膜過濾液體，去除溶液中的雜質。⑤冷凍干燥液體：將溶液放入冷凍室內冷凍保存24 h后取出，用干燥器充分干燥溶液，得到了純度高的白藜蘆醇膠束。

1.2.2納米纖維膜的制備

實驗運用靜電紡絲裝置制備納米纖維膜，具體如圖1所示。其主要由3部分組成：高壓直流電源、噴射裝置及收集器。工作流程：①超聲分散混合物：用量筒量取20 mL的四氟乙烯(TFE)，放入干燥的錐形瓶中，然后用電子天平稱取3 g多孔納米羥基磷灰石(n-HA)。用玻璃棒攪拌均勻，然后用超聲裝置超聲分散1 h；②充分攪拌混勻溶液：用玻璃棒不斷攪拌，控制混合溶液的質量和體積比為固定值12%；③制備共混紡絲液：向混合溶液后加入13 mL體積分數為2%的乙酸溶液，用玻璃棒不斷攪拌，得到實驗所需共混紡絲液；④紡絲制作：嚴格控制紡絲電壓為-1.8 kV/4 kV，噴射裝置與收集器之間的距離不變(13 cm)，發射速度為固定值(0.29 mL/h)，可制備出含n-HA的納米纖維膜；⑤交聯：向納米纖維膜中加入50 mL的EDC/NHS乙醇交聯液，靜置36 h；⑥清除交聯劑：用量筒量取100 mL的無水乙醇溶液，充分洗出納米纖維膜表面的交聯劑，然后利用真空環境保證納米纖維膜真空干燥。殼層溶液為明膠溶液，主要包含72%的白藜蘆醇，芯層溶液為2%的BSA溶液，主要成分為BMP-2。將明膠溶液和BSA溶液作為對照組，實驗包括4組，A組為空白膜組，B組為RES組，C組為BMP-2組，D組為雙載藥組；具體分組情況如表1所示。

圖1 靜電紡絲裝置Fig.1 Electrostatic spinning device

表1 4組同軸納米纖維膜溶液成分表Tab.1 Components of four groups of coaxial nanofiber membrane solutions

1.2.3同軸納米纖維膜的表征

(1)SEM與EDX。4組同軸納米纖維膜分別固定到置物臺之上，向膜上均勻噴灑金，時間72 s，通過SEM對膜的表面形貌仔細觀察。然后，運用EDX分析膜表面的微量元素，試驗設置的電壓為3 kV，試驗完成后，運用統計學軟件對實驗數據進行統計學分析處理；

(2)FTIR。固定材料選用導電膠，利用FTIR數據處理軟件對納米纖維膜的官能團進行統計學分析；

(3)XRD。運用放射電子顯微鏡，將納米纖維膜放置于載玻片上，分析膜的晶體結構；

(4)將4組納米纖維膜分別放置在載物臺上，分別滴3滴去離子水，等待膜與去離子水混合均勻后，用測量工具精細測量接觸角的尺寸，這個過程重復3次，最后測量結果取平均值；

(5)機械性能監測。選用的測量工具為游標卡尺，將膜均分為12 mm×21 mm×0.3 mm，然后使用專門的檢測工具對膜的機械性能進行監測。實驗中需要固定試劑位置，一般固定工具選用砂紙。檢測速度一般設置為1.3 mm/min，繪制應力-應變曲線最高點值為抗拉強度，彈性模量則為曲線的斜率。

1.3 統計學分析

分析軟件選用SPSS26.0，將所有數據導入統計學軟件之中，4個組同軸納米纖維膜之間的組間差異用單因素方差分析方法，當“P<0.05”時，認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇溶液靜電納米纖維膜掃描電鏡結果

4組同軸納米纖維膜溶液制備纖維膜經掃描電子顯微鏡觀察，結果如圖2所示。

從圖2可能看出，A組沒有形成典型的纖維形態，產生了大量串珠樣形狀的物質；B組形成了少量纖維樣結構物質，仍形成了部分串珠樣結構物質，但明顯少于A組；C、D組形成的纖維膜可滿足實驗的要求，纖維膜表面光滑，形態規則，彼此之間差異較小，均呈現立體三維網狀結構。制備過程中D組出現故障，當對D組纖維膜射頻照射時，膜形成不穩定。工作人員通過增加電場強度，可促進膜形成穩定，但是當電場強度增加時，會影響細胞的生理功能，對細胞活性造成不可逆性損傷。通過實驗得出結論，D組溶液配比更合理，即72%白藜蘆醇膠束作為殼層溶液，BMP-2作為芯層溶液。處理軟件選用ImageW，可計算出不同纖維的直徑，并進行比較。結果顯示為伴隨著2%白藜蘆醇質量分數不斷增加，與纖維膜的直徑成正比。由此可繪制直徑分布圖，結果如圖3～圖5所示。

圖3 B組直徑分布圖Fig.3 Diameter distribution of group B

圖4 C組直徑分布圖Fig.4 Diameter distribution of group C

圖5 D組直徑分布圖Fig.5 Diameter distribution of group D

2.2 同軸納米纖維膜對炎癥因子的作用

運用PCR擴增技術對炎癥因子進行擴增，然后檢測牙周膜細胞。運用LPS為誘導劑，反應充足的時間，4組細胞因子表達顯著升高(P<0.05)，主要表現為IL-1、IL-6、MMP-3、MMP-7明顯升高；而C、D組的IL-B、IL-9、MMP-2明顯高于A、B組。

2.3 同軸納米纖維膜對成骨基因表達的影響

本實驗采用2種常規的實驗技術手段：茜素紅實驗和ALP活性檢測，2種方法均可用來測定細胞骨向分化的過程。4組同軸納米纖維膜均在同種培養液及實驗環境下培養，周期為2周。與其他3組結果相比，D組同軸納米纖維膜經茜素紅染色后，通過顯微鏡觀察可發現明顯的橘紅色礦化物，這種礦化物呈結節狀外觀，表面粗糙不平，結節大小不等。

由2名研究員分別記錄4組同軸納米纖維膜在浸提液中培養7、14、28 d的實驗數據，4組纖維膜細胞內ALP表達活性差異較大，研究發現D組納米纖維膜組測試結果與其他3組結果差異較大，ALP活性較其他3個組對照組高(P<0.05)。而且，在D組納米纖維膜經浸提液培養14 d時，ALP活性明顯升高，達到峰值。由此可以推測，ICA對細胞骨向分化有誘導作用，尤其在培養早期，7～14 d時效果更明顯。實驗結果表明，ICA生物活性良好，促進同軸納米纖維膜誘導細胞成骨過程，促進牙周炎牙槽骨細胞再生。

3 討論

牙周炎是一種常見的慢性感染性疾病，主要病理過程是牙周組織的炎癥變化及破壞性改變，牙周炎嚴重影響患者的口腔健康[12]。然而，目前的研究未發現牙周炎發病的具體機制，主要影響因素為炎癥和感染。口腔內存在多種微生物菌群，主要包括牙齦單胞菌、放線桿菌，這2種細菌可產生多種細胞因子，能促發人體的免疫反應機制[13]。

一種新型多酚類植物，具備抗毒素的特性——白藜蘆醇。這種植物具備多種藥用功效，可協助機體抵抗炎癥、抗細胞氧化、殺滅腫瘤細胞等[14]。然而，白藜蘆醇生物利用度低，限制了它的使用價值。它的水溶性低，不易溶于體液之中，而且在胃腸道內的代謝率極高。研究發現，將聚合物膠束作為載體，可攜帶藥物，因此可提高白藜蘆醇的生物利用度，提高白藜蘆醇的藥用價值。

白藜蘆醇有抑制炎癥發展的作用，抗炎效果明顯。當牙周組織被破壞時，不僅需要抗炎，還需要促進骨組織再生[15]。這個過程需要多種生長因子的調控，我們的研究發現BMP-2可誘導骨組織再生，當牙周炎牙槽骨缺損時，局部應用BMP-2即可促進骨組織骨化發生，從而減少缺損愈合時間。

引導組織再生術(GTR)是一種常見的口腔科手術方式，牙科醫師在牙體缺損部位應用屏障膜，可促進新生組織在手術區正常生長，利于美學修復。這種手術方式與傳統的GTR差異不大，不僅可促進牙周周圍軟組織的生長，而且利于硬組織的形成[16]。目前這種手術方式主要在口腔醫學中應用，可以促進牙周骨的生長，促進種植體更好地完成種植。可是目前臨床應用的生物膜只具備阻斷和隔離異物的作用，不具備誘導骨組織再生的能力，因此使用價值有限[17]。人為的添加BMP-2，通過靜電紡絲技術可制得纖維支架，這種支架可促進人骨髓間質干細胞生長發育，進而可誘導成骨細胞的生長和分化[18]。

綜上所述，本實驗應用同軸靜電紡絲技術，殼層選用白藜蘆醇作為載體，芯層選用BMP-2作為載體。這種新型納米纖維膜具備良好的生物相容性，可高度抑制牙周組織周圍的炎癥因子表達，同時對成骨基因的表達有促進作用[19]。這種新技術可為牙周炎治療提供依據，將來可為口腔頜面部骨缺損美容提供治療新方向。

4 結語

實驗結果表明，當術后3個月后進行隨訪，對照組中可觀察到大面積的骨缺損，這種現象也存在于空白膜之中；但結果相對于對照組差異不大。因此，可認為納米纖維膜可部分阻隔異物，達到屏障作用，有利于骨組織的修復過程。芯層負載的BMP-2可促進納米纖維膜的修復過程，縮短修復時間。當雙載藥的同軸納米纖維膜放置在手術區時，第1步是白藜蘆醇釋放，它可以抑制牙周組織的炎癥反應，可形成一種無菌環境，利于BMP-2發揮成骨效應；第2步是BMP-2緩慢釋放，二者物質聯合作用牙槽骨，可加強牙槽骨的修復效果。因此，本研發的同軸納米纖維具備極大優勢，可作為藥物搭載載體，成為一種良好的牙科手術方式。