磷酸肌酸鈉預處理對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用

王亞光 鐘一 高利麗 蔡宏宇

(錦州醫科大學附屬第一醫院 1心內科，遼寧 錦州 121001；2內分泌與代謝疾病科；3腎內科)

肺缺血再灌注損傷(LIRI)常導致移植后原發性移植物功能障礙(PGD)，是導致移植后發病和死亡的主要原因〔1〕。許多接受肺動脈血栓內膜切除術和體外循環的患者或那些從鐮狀細胞肺危象中恢復過來的患者也會有某種形式的LIRI。通過再灌注，形成活性氧，激活細胞內的一系列有害效應〔2，3〕。肺移植后缺血再灌注迅速激活先天免疫系統促進炎癥與損傷。LIRI涉及供體肺細胞與受血者免疫細胞之間復雜的炎癥通訊，導致危及生命的水腫、器官功能障礙和細胞死亡〔4〕。由于缺血預處理涉及機械損傷及倫理，相比較而言，藥物預處理是更為理想的治療方法，因為它不僅無創、安全，最重的是能有效減輕肺缺血再灌注損傷，因而具有非常廣闊的臨床應用前景。磷酸肌酸作為細胞內的能量載體，能夠維持細胞的活性及基本功能〔5〕。外源性磷酸肌酸作為重要的能量補充劑，在治療能量供應不足導致的機體病理變化中發揮著重要作用。此外，磷酸肌酸的膜穩定作用、抗氧化作用、神經保護作用等正逐漸被證實〔6，7〕。本研究旨在探討磷酸肌酸鈉預處理對大鼠肺LIRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠32只，體重250～300 g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，顯微鏡裝置購于日本OLUMPUS公司，全自動血氣分析，購于美國Nova biomedical公司，多功能酶標儀，購于瑞士TECAN公司，酶標儀，購于美國BIOTEK公司，雙垂直蛋白電泳儀、凝膠成像系統購于北京六一公司。總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)試測定試劑盒，腫瘤壞死因子(TNF)-α、大鼠白細胞介素(IL)-1β ELISA檢測試劑盒。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒，購于南京建成公司。注射用磷酸肌酸鈉購于海口力奇制藥股份有限公司。

1.2大鼠肺缺血再灌注模型 大鼠術前自由進食，自由飲水，在22°C下，12 h光/12 h暗周期，濕度為65%，可自由獲取食物和水，20%烏拉坦(500 μl/100 g)麻醉，仰臥位固定于手術臺上，常規剪毛、消毒、鋪巾，取頸前正中切口3 cm，逐層切開分離頸前皮下組織及頸前肌肉組織，暴露、游離氣管，14 G靜脈留置導管氣管插管，接小動物呼吸機，呼吸機參數設置為呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量8 ml/kg，右頸靜脈注射肝素(100 IU/kg)抗凝。待動物呼吸穩定后，取左側胸部第5肋間隙前外側切口，切開胸壁皮膚后，切斷胸壁肌肉逐層進胸，打開胸腔，精細游離并暴露左側肺門，以無損傷血管夾夾閉左肺門45 min后開放(阻斷后肺塌陷，顏色變為暗紫色，開放后再次膨脹，顏色變為淡紅色)。再灌注120 min，實驗全部結束后，采用安樂死的方法處死大鼠(靜脈注射3倍麻醉劑量的烏拉坦)。

1.3實驗分組 健康雄性SD大鼠，32只，體重250～300 g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，10～15周齡，分籠飼養，自由喂水，統一批次，按籠分層隨機均分為Sham組、Sham+磷酸肌酸鈉組、LIRI組、LIRI+磷酸肌酸鈉預處理組各8只。尼可地爾粉劑80 mg充分溶解于100 ml蒸餾水中。Sham組：只進行假手術，開胸后僅游離肺門，不做夾閉處理，其他操作同模型組。Sham+磷酸肌酸鈉組：實驗大鼠進行假手術，并以40 mg/kg的磷酸肌酸鈉予以大鼠尾靜脈注射。LIRI組：以無損傷血管夾夾閉左肺門45 min后開放(阻斷后肺萎縮，變為暗紫色，開放后肺迅速膨脹，顏色恢復淡紅色)，再灌注120 min后靜脈取血，處死大鼠并收集肺組織。LIRI+磷酸肌酸鈉預處理組，實驗大鼠在LIRI的操作前15 min以40 mg/kg的磷酸肌酸鈉予以大鼠尾靜脈注射。

1.4檢測肺組織病理學 2 h再灌結束后，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理學變化〔9〕。肺損傷評分標準見表1。

表1 肺損傷評分表

1.5血氣分析檢測及氧合指數(OI)和呼吸指數(RI)的計算 再灌注120 min后，各組大鼠取動脈血，測氧分壓(PaO2)，二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值。OI=PaO2/吸氧濃度(FiO2)。RI=〔肺泡動脈氧分壓差(P(A-a)DO2)/PaO2〕。P(A-a)DO2=(大氣壓-PH2O)×FiO2-PaCO2/R-PaO2。其中PH2O為蒸汽壓，取恒值47 mmHg，R=0.8，大氣壓統一采用760 mmHg。

1.6肺干濕比重(W/D)的測定 首先，大鼠安樂死后采集肺組織，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中短暫沖洗，擦拭，然后稱重以獲得濕重。在80℃干燥72 h后測定肺的干重，以濕體重除以干體重來計算W/D。

1.7MDA、SOD的檢測 取組織進行準確稱取，然后按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍的生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，制備成10%的勻漿上清液。將組織勻漿上清進行蛋白含量測定。使用MDA、SOD試劑盒測定其含量。

1.8肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β的測定 2 h再灌注結束，收集肺泡灌洗液，離心后保存于-20℃冰箱中至實驗使用，肺泡灌洗液600 g經過800 r/min離心10 min去除沉淀物。按照試劑盒說明，TMB顯色液顯色，酶標儀450 nm讀取吸光值，以標品濃度(pg/ml)為縱坐標，對應光密度(OD)為橫坐標，運用Curve Exert1.3軟件來畫標準品的線性回歸曲線，然后按曲線方程來算出各樣本的濃度值。

1.9MPO活性的測定 冰浴的條件下進行機械的勻漿，制備成10%勻漿，按照試劑盒說明操作。MPO的活力(U/g組織濕重)=(測定OD值-對照OD值)/〔11.3×取樣量(g)〕。

1.10肺組織中細胞凋亡的測定 用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-生物素缺口末端標記(TUNEL)染色來檢測肺凋亡率。

1.11統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行方差分析、Dunn檢驗。

2 結 果

2.1肺組織病理學變化 2 h再灌注結束后，用HE染色測定肺組織損傷的組織學證據。Sham組及Sham+磷酸肌酸鈉組肺組織結構及肺泡完整，肺間隔無明顯增厚，無炎性細胞浸潤；LIRI組肺組織結構發生明顯改變，肺泡堵塞，肺泡形態不完整，大量血液滲出，炎性細胞大量浸潤且分布廣泛，部分集結成團；LIRI+磷酸肌酸鈉預處理組肺組織結構仍有一定變化，肺間隔增厚，有血液滲出，可見部分炎性細胞浸潤。見圖1。與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組肺質傷評分〔(0.128±0.025)分〕差異無統計學意義。LIRI組肺損傷評分〔(0.428±0.026)分〕明顯高于Sham組〔(0.122±0.022)分，P<0.01〕。LIRI+磷酸肌酸鈉組肺損傷評分〔(0.311±0.029)分〕明顯低于LIRI組(P<0.01)。

2.2血氣分析檢測及OI和RI Sham和Sham+磷酸肌酸鈉組pH、PO2、PCO2、OI、RI無顯著差異(P>0.05)。LIRI組PaO2、OI明顯低于Sham組，PaCO2、RI明顯高于Sham組(P<0.01)。LIRI+磷酸肌酸鈉組PaO2、OI均顯著高于LIRI組，PaCO2、RI顯著低于LIRI組(均P<0.05)。見表2。

2.3W/D 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組W/D無明顯差異(4.314±0.312 vs 4.332±0.279，P>0.05)。與LIRI組相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組W/D顯著降低(5.193±0.342 vs 6.231±0.298，P<0.01)。

2.4氧化應激系統的檢測 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組MDA、SOD含量無明顯差異(P>0.05)，LIRI組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低(均P<0.01)。與LIRI組相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組肺組織中MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高(均P<0.01)。見表2。

2.5肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β的測定 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量無明顯差異(P>0.05)，LIRI組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量明顯升高(P<0.05)。與LIRI組相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β濃度明顯降低(P<0.05)。見表3。

圖1 4組肺組織(HE染色，×100)

表2 各組血氣分析和呼吸參數及MDA、SOD水平比較

表3 磷酸肌酸鈉預處理對肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的影響

2.6MPO活性的測定 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組在肺組織中MPO活性無明顯差異〔(1.079±0.126) vs (1.150±0.67)U/g,P>0.05〕。與LIRI組〔(2.993±0.149)U/g〕相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組MPO〔(2.578±0.161)U/g〕活性明顯降低(P<0.05)。

2.7肺組織中細胞凋亡的測定 細胞核內有褐色顆粒的細胞染色呈陽性，正常細胞核是藍色。與Sham組相比，Sham+磷酸肌酸鈉組的比例無明顯差異〔(2.738±1.376)%vs (3.023±1.578)%，P=0.656〕。LIRI組凋亡細胞比例〔(44.768±15.398)%〕明顯高于Sham組(P<0.01)，LIRI+磷酸肌酸鈉組凋亡細胞比例〔(27.498±6.178)%〕明顯低于LIRI組(P=0.038)。見圖2。

圖2 4組肺組織TUNEL染色檢測凋亡細胞(×400)

3 討 論

LIRI是一種常見的臨床現象，多見PCI術后、急性心肌梗死的溶栓治療后、心肺復蘇和器官移植等血管開通后過程中。肺極容易受到損傷，盡管在免疫抑制方面和手術的管理的進步，而肺移植的結局往往是固體器官臟器抑制結局最差的〔10〕。肺移植的成功受的移植肺功能喪失的限制，主要是由LIRI引起，缺血再灌注誘導胞死亡是導致肺功能衰竭和肺組織損傷的重要原因。其機制與肺泡的損傷和血管通透性有關。能量代謝障礙是發病基礎，氧自由基作用是重要發病環節〔11〕。磷酸肌酸是人體內源性的高能化合物，通過“肌酸穿梭”機制完成線粒體氧化磷酸化成三磷酸腺苷(ATP)維持機體正常的能量代謝〔12〕。在病理情況下(缺血缺氧)，能量產生受阻，磷酸肌酸迅速將其磷酸鍵轉移至二磷酸腺苷(ADP)，防止或延遲ATP 的耗盡〔13〕。在腦、心等臟器缺血情況下發揮巨大作用，尤其在心臟疾病中有廣泛的臨床應用，但卻在LIRI中還缺乏基礎及相關的臨床研究。LIRI是多分子、多機制、相互影響的病理演變過程，其發生的機制可能有：無菌性免疫反應(先天性免疫、獲得性免疫)、補體激活、凝血激活、細胞死亡途徑的激活(凋亡、壞死、自噬)、內皮功能異常、自由基氧化作用等有關〔14〕。強大的氧化應激，是迅速發生再灌注后LIRI的主要啟動因子，MDA，氧化應激介導的脂質過氧化的標志，SOD是重要的抗氧化酶〔15〕。MDA是氧化應激所致損傷的一個標志，而SOD水平通常用于評估對細胞毒性活性氧物種的一級防御〔16〕。肺細胞凋亡在LIRI中起著重要作用〔17〕。磷酸肌酸鈉預處理在 LIRI開始前15 min以40 mg/kg的劑量靜脈注射，可顯著降低肺組織病理學改變，改善肺功能。肺組織中MDA及肺水腫程度減輕，SOD活性顯著升高。磷酸肌酸鈉預處理明顯降低肺組織細胞凋亡率。TNF-α和IL-1β的表達在肺缺血再灌注早期顯著上調。中性粒細胞在肺內的激活和積聚是產生肺損傷的重要因素〔18〕，而MPO是中性粒細胞脫顆粒釋放的溶酶體，其表達水平的升高表明白細胞在肺內浸潤程度高〔19〕。磷酸肌酸鈉預處理降低肺組織中MPO含量表達，降低支氣管肺泡灌洗液的炎癥介質表達，表明尼可地爾可以抑制肺缺血再灌注產生的炎癥反應起到保護作用。

本研究驗證了磷酸肌酸鈉預處理的有效性，在大鼠肺LIRI模型中，具有肺保護作用。其次磷酸肌酸鈉預處理可能的肺保護機制。其機制可能是通過抑制活性氧生成和抗細胞凋亡有關，抑制無菌性免疫炎癥反應。這將為擴大磷酸肌酸鈉在臨床上的應用提供新的理論依據，其進一步的作用機制值得更深層次的研究。