ERK/Smad通路在BMP2介導的牙髓干細胞增殖、分化中的作用

沈玉芹 崔娟娟 魯曉娟

(1皖西衛生職業學院附屬醫院口腔科，安徽 六安 237000；2安徽醫科大學第一附屬醫院口腔科)

牙髓干細胞(DPSCs)是存在于牙髓中的一種具有多向分化潛能的成體干細胞，是牙本質再生的重要種子細胞〔1〕。近年來，以DPSCs作為種子細胞實現牙髓牙本質再生修復的研究受到國內外學者的廣泛關注〔1〕。骨形成蛋白(BMP)2可誘導和調控DPSCs向成牙本質細胞分化〔2〕，研究證實，BMP2可通過激活細胞信號轉導分子SMAD家族成員1/5/8(Smad1/5/8)途徑，促進DPSCs中的Smad1-Runt相關轉錄因子蛋白(Runx)2和Runx2-牙本質涎磷蛋白(DSPP)相互作用，調控DPSCs分化〔3，4〕。近來研究發現，細胞外調節蛋白激酶(ERK)通路也參與調控DPSCs成骨、成牙分化過程〔5，6〕，且已有研究發現ERK通路阻滯劑能夠抑制Runx2的活化〔7〕，并阻斷Smad1/5/8和ERK1/2信號在Runx2的會聚，調控DPSCs的牙母質分化〔8〕。但BMP2與ERK/Smad通路之間的調控機制還不甚明確。給予ERK1/2抑制劑能否完全逆轉BMP2促進干細胞成骨分化作用還未見報道。本研究對此進行探究驗證，以期闡明BMP2在DPSCs牙髓牙本質再生修復過程中的其他可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 人前磨牙牙髓干細胞(hDPSCs)(貨號：HZNC024，購自上海滬震實業有限公司)；胎牛血清DMEM培養基和兔抗人CD44、CD34、CD29、骨唾液蛋白(BSP)多克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(貨號：E510002、E600010、D261338、D263155、D261488、D190090上海生工生物工程股份有限公司)；ERK通路抑制劑U0126(上海碧云天生物科技有限公司，貨號：S1901)，兔抗人ERK1/2、磷酸化(p)ERK1/2、DSPP、Runx2抗體(貨號：ab17942、ab223500、ab272929、ab236639，均購自美國Abcam公司)；Smad1/5/8、p-Smad1/5/8抗體(貨號：10822-100，10823-1001，購自艾美捷科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)染液及活性測定試劑盒(貨號：D001、A059，購自南京建成生物工程研究所)，茜素紅、逆轉錄試劑盒(貨號：G8550、T2210，均購自北京索萊寶生物科技有限公司)。重組腺病毒(Ad-GFP)、攜帶BMP2基因的腺病毒載體(Ad-BMP2)均由美國芝加哥大學醫學中心何通川教授團隊構建并饋贈。

1.2hDPSCs培養、鑒定 取液氮中凍存的hDPSCs細胞，常規復蘇后，以胎牛血清DMEM培養基吹成混懸液；轉入6孔板中，在5%CO2、37℃條件下常規培養；2 d后半量換液，收集上清液，加入DMEM培養基進行常規培養，待細胞生長至85%融合度時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集生長良好的第3代hDPSCs，調整細胞濃度為105個/ml后，以每孔200 μl接種至6孔細胞板上。常規培養過夜后，棄上清液，經磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，用4%多聚甲醛固定20 min、0.5% Txion X-100處理20 min、3%H2O2處理15 min，反復漂洗后，以山羊血清封閉10 min；加入稀釋一抗(CD29、CD34、CD44、波形蛋白、角蛋白抗體，稀釋倍數為1∶200)，于4℃下孵育過夜，并將加入等量的PBS作為陰性對照；次日，加入二抗(生物素標記)于37℃下孵育20 min；經鏈霉卵白素(辣根酶標記)孵育20 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色10 min后，樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3hDPSCs分組與處理 取生長良好的第3代hDPSCs細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清DMEM培養基配制成密度為5×104個/ml的細胞懸液，接種于48孔板上，并分為空白組、熒光蛋白(GFP)組、BMP2〔9〕組、BMP2+ERK通路抑制劑(U0126)〔6〕組，每組設置6個復孔。于37℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞貼壁培養6 h后，空白組不做任何處理并進行正常培養；GFP組加入終濃度為80 ng/ml的重組腺病毒(Ad-GFP)溶液及終濃度為8 mg/L的聚凝胺以增強病毒轉染；BMP2組加入終濃度為80 ng/ml的攜帶BMP2基因的腺病毒載體(Ad-BMP2)溶液及終濃度為8 mg/L的聚凝胺的溶液進行轉染；BMP2+U0126組在BMP2組基礎上加入終濃度為25 μmol/L的U0126溶液。各組細胞處理后置于37℃，5% CO2孵箱中培養8 h后更換新鮮培養基，并分別于轉染后48 h觀察熒光表達情況，并用RT-qPCR法檢測細胞中BMP2 mRNA表達情況，以判定BMP2基因轉染效果。

1.4CCK-8法檢測各組細胞增殖情況 取生長良好的第3代hDPSCs細胞，按1.3方法分組處理后，分別取轉染后培養1、3、5 d的各組細胞，加入10 μl CCK-8，于37℃條件下孵育4 h后用酶標儀檢測562 nm波長下的吸光值，繪制細胞生長曲線。

1.5ALP染色檢測ALP活性 收集處理7 d后的各組細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，加入ALP染色30 min后洗去染色液后，置于顯微鏡下觀察拍照，并采用Image pro-plus軟件測定染色區域所占百分比，染色區域所占百分比=(染色面積/總面積)×100%。

1.6茜素紅染色 將長勢良好的第3代hDPSCs按照每孔106個細胞接種至6孔板上，按照1.3方法分組處理21 d后，棄培養液；經4%多聚甲醛固定、磷酸緩沖液洗滌后，加入1%茜素紅溶液染色15 min，洗去染色液后，顯微鏡觀察拍照。

1.7RT-qPCR檢測 收集處理7 d各組細胞，利用Trizol試劑盒提取總RNA，取1 μg RNA逆轉錄合成單鏈cDNA后，將cDNA作為模板行實時熒光定量PCR反應，2-ΔΔCt法計算hDPSCs中BMP-2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達水平，GAPDH作內參照。其中，反應條件如下：95℃ 120 s(1個循環)，95℃ 30 s、55～60℃ 30 s、72℃ 30 s(40個循環)，72℃ 300 s(1個循環)；由大連寶生物公司合成的RT-qPCR擴增引物序列如下：BMP2上游引物5′-TCTTCTCCAATGACCGCAGCAATG-3′、下游5′-CTCCTCCTCTTGGCTCTCACCTG-3′；Runx2上游引物5′-CCAACCCACGAATGCACTATC-3′、下游5′-TAGTGAGTGGTGGCGGACATAC-3′；DSPP上游引物5′-TTCCGATGGGAGTCCTAGTG-3′、下游5′-TGAGCTTCTGGGTGTCCTCT-3′；BSP上游引物5′-GATTTCCAGTTCAGGGCAGTAG-3′、下游5′-CCCAGTGTTGTAGCAGAAAGTG-3′；GAPDH上游引物5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′、下游5′-GTAGAGGCAG GGATGATGTTCT-3′。

1.8Western印跡檢測 收集處理7 d各組細胞，加入細胞裂解液抽提總蛋白后，采用二喹啉甲酸法檢測總蛋白濃度；將變性后的蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以半干法轉膜；脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯膜2 h后，加入一抗(ERK1/2、p-ERK1/2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP抗體，稀釋倍數為1∶2 000，內參抗體為GAPDH，稀釋倍數為1∶2 000)，在4℃下孵育過夜；次日，加入稀釋5 000倍的二抗于室溫下孵育1 h。顯影曝光后，化學發光成像分析系統拍照并分析灰度值。每組試驗重復3次。

1.9統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1hDPSCs形態及鑒定結果 傳代培養第3代hDPSCs細胞呈長梭形且有凸起。免疫細胞化學染色結果顯示，波形蛋白染色呈陽性，角蛋白染色呈陰性，說明細胞具有成纖維細胞的形態特征，符合牙髓細胞的生物學特征。CD29及CD44呈陽性表達，CD34呈陰性表達，符合干細胞特征。見圖1。

圖1 hDPSCs形態及鑒定(DAB)

2.2各組細胞BMP2轉染效果 用腺病毒轉染hDPSCs細胞后均呈綠色熒光表達。且轉染后48 h，與空白組相比，GFP組細胞BMP2 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；BMP2組、BMP2+U0126組細胞BMP2 mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。與BMP2組相比，BMP2+U0126組BMP2 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.3轉染BMP2后對hDPSCs細胞增殖的影響 隨著培養時間的延長，各組細胞均逐漸增多，且各組細胞均在5 d時達到峰值，7 d時下降至接近3 d水平。與空白組中相比，GFP組在1～7 d時，細胞增殖差異無統計學意義(P>0.05)；BMP2組3～7 d時細胞增殖最多(P<0.05)。與BMP2組相比，BMP2+U0126組3～7 d時細胞增殖明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.4ALP染色結果及其活性比較 與空白組比較，GFP組細胞染色無明顯變化，細胞染色區域所占百分比差異無統計學意義(P>0.05)；BMP2組細胞染色區域所占百分比明顯升高(P<0.05)；與BMP2組比較，BMP2+U0126組上述指標明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

2.5茜素紅染色結果 與空白組比較，GFP組細胞染色無變化，BMP2組細胞染色加深且礦化結節增多；與BMP2組比較BMP2+U0126組染色變淺礦化結節減少。見圖4。

表1 各組細胞轉染后48 h BMP2 mRNA及ALP活性及不同時間細胞增殖比較

圖2 各組hDPSCs腺病毒轉染后綠色熒光表達(免疫熒光染色，×100)

圖3 各組hDDSCs ALP染色(×200)

2.6RT-qPCR檢測結果 與空白組比較，GFP組細胞BMP2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；BMP2組細胞中BMP2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。與BMP2組比較，BMP2+U0126組細胞中Runx2、DSPP和BSP mRNA表達明顯降低(P<0.05)，BMP2 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.7Western印跡檢測結果 與空白組相比，GFP組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；BMP2組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。與BMP2組比較，BMP2+U0126組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。見表3、圖5。

表2 各組細胞中BMP2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達

表3 各組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平比較

圖5 Western印跡檢測各組p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達

3 討 論

齲病、牙髓病等口腔疾病損傷牙髓及牙本質細胞時，牙髓中的hDPSCs可增殖、分化成成牙本質細胞、骨細胞等多種細胞而修復受損牙齒及丟失的骨組織〔10〕。hDPSCs的高度增殖、自我更新及多向分化能力，為牙組織再生修復工程及牙髓疾病的治療帶來了新的希望〔11〕。但hDPSCs增殖、分化及牙本質再生修復過程中的分子機制復雜且不明確，這嚴重限制了應用組織工程實現牙體牙髓再生的進程〔12〕。

BMP2具有骨誘導活性，其可在缺損骨組織中誘導未分化干細胞轉化為骨母細胞，并進一步形成骨組織〔13〕。研究證實，在牙胚發育過程中，BMP2可通過自分泌或旁分泌形式，表達于成釉上皮細胞、牙乳頭細胞、牙囊細胞和牙胚周圍的成骨細胞中促進本質及牙基質的分化再生〔14〕。近年來，大量體內外試驗均證實BMP2參與牙髓組織損傷修復過程，王皓等〔15〕發現在先天性牙齒發育不全患者體內檢測到牙齒BMP2基因突變及異常，提示BMP2與牙齒發育關系密切。浦鐵民等〔16〕及仵韓等〔17〕體外研究試驗發現BMP2可通過調節細胞的增殖狀態，促進牙髓細胞ALP合成等作用，誘導牙髓細胞向成骨及牙本質分化，證實BMP2與牙髓組織修復關系密切。本研究給予hDPSCs轉染BMP2基因后，hDPSCs細胞增殖、礦化能力、牙本質細胞分化標記基因DSPP基因及蛋白、成骨分化標志基因BSP表達均顯著高于空白組，證實了BMP2可誘導hDPSCs增殖分化及在牙髓組織損傷修復過程中扮演重要角色。然而干細胞分化是一個復雜的過程，需要多種生長因子、胞外基質及細胞本身特性共同作用〔18〕，BMP2在hDPSCs分化這個復雜的調控網絡中，如何與其他因子協同作用誘導細胞分化，仍需要繼續探討。

BMPs家族蛋白發揮生物學效應的分子機制與Smads介導的信號通路關系密切，研究證實，靶細胞膜上BMPs受體需要細胞質內各型Smads蛋白協同參與BMPs生物調控作用〔19〕。Qiu等〔3〕及任格等〔20〕發現BMPs中的BMPR-Ⅰ與BMPR-Ⅱ結合在一起，可促使Smad1/5/8發生磷酸化形成p-Smad1/5/8，然后p-Smad1/5/8在細胞核內與Smad4結合形成一個異質二聚體，從而激活靶基因如成骨相關Runx2的表達，促進干細胞向成骨分化；而阻斷Smad1/5/8信號通路及其磷酸化水平后，BMPs促進干細成骨作用及成骨分化相關基因Runx2表達水平也顯著下降，提示BMPs促進干細胞成骨分化過程中需要Smad1/5/8通路的調控。本研究提示，BMP2可介導Smad通路活化，參與hDPSCs細胞分化過程。但又有研究發現，用Smad1/5/8抑制劑抑制Smad1/5/8表達后，并不能完全阻斷Runx2及成骨分化活性，而用BMP2抑制劑卻可完全阻斷Runx2及成骨分化活性〔21〕，提示BMP2調控干細胞成骨分化作用，除了Smad通路參與外，還可能有其他通路共同參與。Li等〔8〕用Ca2+刺激hDPSCs細胞后，檢測了與BMP2相關的信號通路如ERK、末端激酶或應激活化激酶(JNK)、p38絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)三條通路分子的磷酸化水平，發現只ERK磷酸化水平在hDPSCs中表達升高，提示BMP2調控hDPSCs成骨及牙本質細胞分化過程中，ERK通路也發揮重要調控作用。Park等〔22〕發現抑制小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1細胞中ERK1/2磷酸化水平，導致磷酸Smad1/5/8和Runx2水平的下調，進而降低成骨細胞ALP、礦化及Runx2活性，提示ERK1/2可通過Smad/Runx2途徑調控細胞成骨分化。本研究結果提示，ERK1/2通路抑制劑可逆轉BMP2促進hDPSCs細胞增殖、分化作用，表明ERK/Smad通路在BMP2介導的hDPSCs細胞增殖、分化作用中發揮重要作用，BMP2與ERK之間可能存在間接或直接的靶向調控作用。