miRNA-194-5p通過減少神經炎癥降低腦卒中風險

王霞 李美 王冰 陳秋菊 李巖 劉振元 張文奇

(衡水市人民醫院(哈勵遜國際和平醫院)康復醫學科，河北 衡水 053000)

在血管風險高發、人口統計學巨變(老齡化、城市化)、生活方式欠佳(久坐、飲食)和經濟快速發展的背景下，腦卒中的發病率、致殘率、死亡率呈升高趨勢，已成為威脅中老年人健康的一大公害〔1〕。急性缺血性腦卒中(AIS)作為一種危重的醫學急癥，其病因尚未確定，目前需要利用多種評估工具進行及時的評估，包括非對比頭顱電子計算機斷層掃描(CT)檢查、磁共振成像(MRI)評估量表，這些評估工具非常有效，但也有其局限性，比如對特定腦區的敏感性有限〔2〕。在AIS的治療方面，腦卒中后4.5 h內靜脈注射重組組織纖溶酶原激活劑仍是臨床首選，而由于缺乏對院前腦卒中癥狀的快速識別，AIS患者的及時干預常常受到阻礙〔3〕。

微小RNA(miRNAs)被認為是重要的調節因子，可以作為人類疾病的診斷生物標志物或治療靶點，為研究潛在的新治療方法提供了機會。很多研究表明miRNAs可以通過調節血管生成參與AIS的形成〔4，5〕。miRNA-194-5p已經在多種癌癥中得到了很好的研究，并且在順式細胞癌患者中也被證實是下調的〔6〕。也有研究表明在低溫氧葡萄糖剝奪處理的神經元中，miRNA-194-5p的表達顯著下調，在miRNA-194-5p介導神經元死亡的調控種，其下調對特定靶蛋白SUMO2缺血耐受至關重要，miRNA-194-5p在通過調節SUMO2調節深低溫循環停止反應中發揮獨特作用。這些發現提示miRNA-194-5p可能是缺血性疾病干預治療的潛在靶點〔7，8〕。然而，miRNA-194在AIS中的作用尚未見報道。miRNA-194-5p對AIS 及其相關炎癥的作用和機制尚不清楚。本研究旨在探索miRNA-194-5p對AIS相關炎癥的作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年12月衡水市人民醫院神經內科就診的AIS患者72例為腦卒中組，男38例，女34例，年齡58～68歲；同期72例無腦血管病健康志愿者為正常組，男37例，女35例，年齡61～67歲。納入標準：①臨床確診為AIS，入院前行頭部CT排除腦出血；②臨床資料完整；③首次發病且于3 d內入院。排除標準：①發病前有顱腦或精神創傷者及合并其他神經系統疾病;②年齡<18歲;③顱內出血或合并梗死后出血;④合并腫瘤及心肺功能不全；⑤合并自身免疫性疾病。取血樣，4℃離心10 min，得血清，-80℃保存。經CT或MRI檢查證實為AIS。本研究經醫院倫理委員會批準，并獲得每位患者的書面知情同意。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，從血清和細胞中收集總RNA。運用RT試劑盒(TaKaRa Bio，Inc)合成cDNA。反應在20 μl體積內進行，每個基因包含1 μl引物(10 μmol/L)、1 μl cDNA、10 μl SYBR Premix EX TaqTM(Takara Bio，Inc)和8 μl無核糖核酸酶水。RT-PCR使用LightCycle?96裝置(羅氏，中國上海)進行。用2-ΔΔCt法分析mRNA表達量。

1.3細胞培養 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購自美國Ambion公司。HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中生長，細胞在37℃和5%CO2下孵育。使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，miRNA-194-5p、simiRNA-194-5p、siTRAF6和對照質粒(上?；蛑扑幱邢薰?轉染HUVECs。①細胞分為正常組和脂多糖(LPS)模型組，培養48 h后，將100 ng/ml LPS加入LPS誘導組HUVECs中，孵育48 h，建立LPS誘導的HUVECs模型，并檢測6、12、24、48 h的miRNA-194-5p表達。②將LPS誘導培養48 h的HUVECs分為空白組、miRNA-194-5p組、simiRNA-194-5p組，分別轉染相應的質粒，培養12 h后，檢測miRNA-194-5p 、炎癥因子、TRAF6 mRNA、TRAF6蛋白表達情況。③將LPS誘導培養48 h的HUVECs分為空白組，simiRNA-194-5p組，simiRNA-194-5pa+siTRAF6組，分別轉染相應的質粒，培養12 h后，檢測TRAF6、炎癥因子表達。

1.4雙熒光素酶報告分析 使用了miRNA靶點預測軟件分析miRNA-194-5p的作用靶點。確定TRAF6的3′-UTR與miRNA-194-5p的結合位點。使用Lipofectamine2000(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)誘導HUVECs轉染TRAF6-miRNA-194-5p 和TRAF6-negative 。轉染24 h后，使用雙熒光素酶分析系統進行報告分析。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA試劑盒用于細胞上清中炎癥因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平檢測。使用FLUOstar-Omega微孔板閱讀器(BMG-Labtech股份有限公司)在450 nm波長處檢測吸光度。

1.6Western印跡分析 使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。然后在10%的凝膠上用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(50 μg/ml)，并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，用(TRAF)6和GAPDH抗體在4℃孵育12 h。然后用辣根過氧化物酶結合的抗兔IgG二級抗體孵育膜2 h。使用增強化學發光試劑盒(EMD Millipore)對蛋白質條帶進行可視化，并使用密度測定法(Quantity One 4.5.0軟件；Bio-Rad Laboratories，Inc)對蛋白進行定量。實驗重復3次。

1.7統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗，方差分析和Tukey檢驗。

2 結 果

2.1miRNA-194-5p在腦卒中患者血清的表達 腦卒中組miRNA-194-5p表達(0.39±0.15)顯著低于正常組(1.00±0.08，P<0.05)。

2.2LPS誘導的HUVECs中miRNA-194-5p的表達 與正常組相比，LPS模型組各時間點miRNA-194-5p表達水平顯著下降(均P<0.001)。見表1。

表1 LPS誘導HUVECs中miRNA-194-5p表達

2.3miRNA-194-5p抑制神經炎癥發展 與空白組比較，miRNA-194-5p組在miRNA-194-5p質粒作用下顯著激活HUVECs miRNA-194-5p表達量(P<0.001)。與空白組比較，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。見表2。

表2 激活miRNA-194-5p對HUVECs模型中炎癥因子的影響

2.4下調miRNA-194-5p 促進神經炎癥發展 與空白組比較，simiRNA-194-5p組在simiRNA-194-5p作用下顯著抑制HUVECs miRNA-194-5p表達量(P<0.001)。與空白組比較，下調miRNA-194-5p表達，可明顯激活HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。見表3。

表3 下調miRNA-194-5p 對HUVECs模型中炎癥因子的影響

2.5miRNA-194-5p通過TRAF6靶點抑制神經炎癥發展 miRNA-194-5p與TRAF6的結合位點，見圖1。與空白組與TRAF6組比較，miRNA-194-5p與TRAF6的熒光素酶表達量顯著偏低(P<0.05)?？瞻捉M，激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 mRNA及蛋白表達，下調miRNA-194-5p顯著激活TRAF6 mRNA及蛋白表達(P<0.05)。見圖2、圖3、表4。

圖1 miRNA-194-5p與TRAF6的結合位點

圖2 激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 蛋白表達量

圖3 下調miRNA-194-5p顯著激活TRAF6 蛋白表達量

表4 miRNA-194-5p通過TRAF6靶點抑制神經炎癥發展

2.6調控TRAF6參與miRNA-194-5p抑制神經炎癥發展 用siTRAF6顯著抑制下調miRNA-194-5p對TRAF6蛋白表達量，與simiRNA-194-5p組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與simiRNA-194-5p組比較，下調TRAF6可顯著減少下調miRNA-194-5p對HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 調控TRAF6參與miRNA-194-5p抑制神經炎癥發展

1～3：空白組、simiRNA-194-SP組、simiRNA-194-5p+siTRAF6組

3 討 論

AIS是世界上神經系統發病率和死亡率的重要原因之一〔9〕。免疫系統在腦缺血損傷后的病理生理變化中起著復雜的作用，腦卒中通過激活自主神經系統和應激軸誘導免疫反應的抑制，顯著促進腦卒中相關炎癥的發展。免疫應激的生物標志物被認為是預測腦卒中相關感染的可靠指標〔10〕。開發生物標志物來指導腦卒中預后和相關性炎癥，將有助于對腦卒中高?；颊叩谋O測和預防性抗感染治療。到目前為止，還沒有一種生物標志物或生物標志物模式能夠充分預測感染或具有足夠的陰性和陽性預測值為臨床提供可靠的靶點〔1，10〕。miRNA-194-5p/NXPH1軸在神經炎癥相關疾病的發生發展中發揮重要作用。這一發現將為生物醫學和神經科學研究開辟新的途徑〔11〕。本研究結果說明miRNA-194-5p可能參與腦卒中相關疾病的發生和發展。

miRNAs可能針對數百種不同的mRNAs，調節基因表達，在細胞形成、分化、增殖和凋亡中具有重要作用，很多mRNAs并被認為是參與神經元保護基因表達的關鍵調控因子〔12〕。研究表明，缺血性腦卒中改變了小鼠和人類多個miRNA的表達，并具有改變細胞應激反應的能力。此外，腦卒中誘導的神經炎癥事件，特別是小膠質細胞反應在miRNAs水平上受到調節〔13〕。研究表明NF-κB激活可下調LPS誘導的急性肺損傷(ALI)中miRNA-194的表達。miRNA-194的過度表達減輕了LPS誘導的ALI，并通過靶向CXCR4降低了炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。在LPS誘導的ALI中，NF-κB通過抑制miRNA-194的表達介導CXCR4的表達，從而促進肺組織的炎癥損傷〔14,15〕。有人認為在LPS誘導后，miRNA-194在新生兒臍血粒細胞中的表達下調，表明miRNA-194在LPS刺激的TLR信號通路中的作用〔16〕。另一項研究報道miR-194可以通過靶向TRAF6調節棕櫚酸誘導的人THP-1細胞TLR4炎癥反應〔17〕。此外，miRNA-194還可以通過介導TLR4的表達來調節LPS誘導的NF-κB信號〔18〕。本研究發現，在LPS誘導的HUVECs模型中 miRNA-194-5p的表達被顯著抑制，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。Chen等〔19〕研究發現，下調miRNA-194-5p表達，HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平被激活。這些表明miRNA-194-5p可以抑制神經炎癥，但機制尚不清楚。

TRAFs家族是一種多功能的細胞內因子，最初發現它與細胞中的不同TNF直接結合，并存在于多種生物細胞中〔20〕。TRAF6與典型TRAF蛋白結構同源性最小，TRAF-C結構域差異最大〔21〕。越來越多的證據表明，TRAF6除了作為適應性蛋白外，還可以作為E3泛素連接酶調節下游信號通路。TRAF6可以介導炎癥因子信號的表達，在大腦中動脈閉塞模型中發現TRAF6的表達水平明顯升高，腦水腫明顯，但應用TRAF6抑制劑后，腦梗死面積減小，腦水腫程度減輕，免疫組化和Western印跡檢測顯示TRAF6的表達也明顯減少〔22〕。同樣，一些臨床試驗表明，在AIS患者外周血中，TRAF6作為TLR4信號通路激活后的下游分子，在腦缺血中發揮著最重要的作用，對缺血性腦損傷的預后有重要影響〔23〕。本研究發現，激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 蛋白表達量。抑制TRAF6表達減少下調miRNA-194-5p對神經炎癥發展的作用。 Kong等〔24〕研究發現，miRNA-194調控TRAF6表達，抑制LPS誘導的椎間盤髓核細胞炎癥反應。提示，miRNA-194-5p可能通過調控TRAF6，減少神經炎癥阻止腦卒中風險。

綜上，腦卒中患者血清中miRNA-194-5p表達顯著降低，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中炎癥因子。同時miRNA-194-5p通過調控TRAF6靶點，抑制腦卒中相關神經炎癥。提示，miRNA-194-5p可能作為臨床治療腦卒中相關神經炎癥重要指標，但其作用機制還有待進一步探討。