NRG-1對1型DM大鼠背根神經節影響的機制

李海濤 林勁 韓麗珍 王裕岱 滕麗峰

(海南省人民醫院(海南醫學院附屬海南醫院) 1心血管內科,海南 海口 570311;2病案室)

糖尿病(DM)是目前臨床高發的慢性疾病，隨疾病發展可出現多種并發癥，威脅患者生命安全。其中糖尿病神經病變(DNP)屬于DM常見并發癥，患者主要癥狀表現為活動能力下降、下肢感覺障礙等，甚至部分患者因控制不佳需截肢〔1,2〕。DNP早期癥狀一般為下肢刺痛感、麻刺感或手腳麻木等，因癥狀特異性差往往被忽視。研究指出，DNP癥狀的發生與神經末梢病變有關，受疾病影響神經末梢軸突可塑性降低，導致神經再生困難〔3〕。DM患者最顯著表現為糖代謝失衡，而隨機體糖代謝失衡，多種激素介質分泌失調，使遠端神經纖維生長受限。神經調節蛋白(NRG)-1屬于神經調節蛋白家族，其胞外結構域與表皮生長因子相似，但是其具有較為保守的胞內結構域(NRG-1-ICD)。不過NRG-1對DM背根神經節的作用未見相關報道。本研究以1型DM大鼠為研究對象，探究NRG-1對DM背根神經節的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取成年SPF級雄性健康大鼠，體重180～210 g，平均體重(200.5±2.4)g，所有大鼠購自賽業生物科技有限公司。

1.2實驗試劑及儀器 青鏈霉素混合液、鏈脲佐菌素(STZ)、谷氨酰胺購于青島浩賽科技股份有限公司；NRG-1、胰酶粉購于ProSpec公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購于北京百普賽斯生物科技有限公司；即用型正常山羊血清購于上海昊海生物科技有限公司；生長相關蛋白(GAP)-43一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、整合素(ITG)B1一抗、磷酸化黏著斑激酶(p-FAK)一抗、Tau 一抗均購于CST公司；微管蛋白(Tubulin)-βⅢ 一抗購于Proteintech 公司；局部黏著斑激酶(FAK)一抗、蛋白激酶B(AKT)一抗、Tau 一抗均購于武漢阿斯本生物技術有限公司。細胞培養箱購于上海鼎科科學儀器有限公司；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡購于上海萬衡精密儀器有限公司；細胞計數板購于美國 Thermo 公司；多功能酶標儀、流式細胞儀購于貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；定量PCR儀購于德國Eppendorf公司；共聚焦顯微鏡購于上海聚儀檢測科技有限公司。

1.3造模 進行DM大鼠誘導，采用STZ法進行，在標準條件下進行1 w的適應性飼養，在進行DM誘導前需禁食12 h，誘導當天對所有大鼠進行稱重，并進行標記，抽取尾靜脈血，對其血糖濃度進行檢測。進行檸檬酸鈉緩沖液配制，將STZ按65 mg/kg的劑量為大鼠進行腹腔注射。對照組大鼠檸檬酸緩沖液注射劑量根據其重量進行計算。體重及尾靜脈血糖濃度檢測時間為完成注射72 h后，當大鼠持續1 w血糖濃度在16.8 mmol/L以上時，則確定本次DM大鼠模型造模成功。

1.4分離培養大鼠背根神經節神經元細胞 處死DM大鼠及對照組大鼠，斷頭后將脊柱取出，使用含雙抗的平衡鹽溶液(D-Hank)進行3次沖洗，使近端的椎管口進一步暴露，棘突向上，橫斷剪開與椎管二分之一處，該操作過程中注意保護背根神經節，分離脊髓雙側背根神經節(DRG)，在顯微鏡下進行解剖，并使用顯微剪剪碎處理好的DRG組織，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12和1×trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，經過濾、離心處理，棄上清后進行重懸，計數細胞后將阿糖胞苷加入。

1.5免疫熒光檢測 對組織細胞進行免疫熒光檢測，步驟如下：①爬片固定；②細胞通透；③封閉；④一抗孵育；⑤二抗孵育；⑥細胞核染色；⑦制片；⑧拍照。

1.6Western印跡檢測 步驟如下：①制備蛋白樣品；②測蛋白濃度；③蛋白變性；④配膠；⑤電泳；⑥轉膜；⑦封閉、抗體孵育；⑧曝光。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 步驟如下：①提取樣本細胞總RNA；②RNA濃度與純度分析；③cDNA合成；④PCR引物設計與合成；⑤PCR。引物ITGB1上游：5′-ATGCTATOCCAACTACACTGGC-3′，下游:5′-CACCAAGGCAGGTCTGACAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游:5′-CGCTAACATCAAATGGOGTG-3′，下游5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。

1.8siRNA轉染 合成siRNA并將合成的siRNA置于-20℃冰箱中保存，期間注意避光。在DMEM/F12中對提取DM的DRHs細胞進行4～6 h培養，將樣本按照隨機方法將DM大鼠DRGs細胞隨機分為4組，第1組為空白對照組(DM組)，第2組在培養基中加入濃度為20 ng/ml的NRG-1(DM+N組)，第3組在第2組基礎上加入ITGB1-siRNA(DM+N+si組)，第4組在對照組基礎上加入ITGB1-siRNA (DM+si組)。每組分別設置3個復孔，取無菌的EP管進行細胞轉染，加入對應試劑，待DRGs細胞完成貼壁后將雙抗的Neurobasal/B27 培養液加入進行72 h孵育。

1.9統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1鑒定DRG神經元細胞 外形呈梭形或多角形，胞體較小，無突起，折光度差，邊緣毛躁的細胞可能是成纖維細胞。經染色后，神經元細胞胞質為綠色，細胞核為藍色，在將B、C圖進行融合后，可明顯觀察到孤立藍色著色點，猜測該類染色細胞可能為雜質細胞，對于染色細胞核占比進行計數，確定本次研究細胞純度在90%以上，見圖1。

A:顯微鏡下神經元細胞；B：Tubulin-βⅢ特異性染色的神經元細胞；C：染色后的神經元細胞核；D：B和C兩圖融合后成像

2.2ITGB1、AKT、FAK在DM大鼠DRGs細胞中的表達 NC組為大鼠原代神經元細胞，DM組為DM大鼠神經元細胞。DM組神經元細胞ITGB1mRNA含量明顯低于NC組(P<0.05)，DM組神經元細胞內ITGB1、FAK、p-FAK及AKT表達均明顯低于NC組(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 ITGB1、AKT、FAK在DM大鼠DRGs細胞中的表達

圖2 兩組ITGB、FAK、AKT蛋白表達

2.3不同NRG-1濃度對神經元突觸再生能力的影響 NRG-1可使GAP-43與Tau表達上調，與0 ng/ml比，20 ng/ml濃度時其上調效果最為明顯，各組間差異有統計學意義(P<0.05)，NRG-1可促進軸突生長，且20 ng/ml濃度時其促進作用作為明顯，各組間軸突長度具有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖3、圖4。

表2 不同NRG-1濃度對神經元突觸再生能力的影響對比

圖3 各組細胞Tubulin-βⅢ軸突長度免疫熒光染色(μm，×50)

1～5:0 ng/ml NRG-1組、10 ng/ml NRG-1組、20 ng/ml NRG-1組、50 ng/ml NRG-1組、100 ng/ml NRG-1組

2.4在軸突再生過程中ITGB1/FAK/AKT通路作用分析 DM+N組、DM+N+si組ITGB1、FAK、p-FAK、AKT及Tubulin-βⅢ表達明顯高于DM組，而DM+si組明顯低于DM組(P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 各組ITGB1/FAK/AKT通路相關蛋白表達

表3 各組軸突再生過程中ITGB1/FAK/AKT通路作用對比

3 討 論

DM最常見的并發癥包含DPN，隨疾病發展，嚴重影響患者的生存質量。對單純DM及DNP患者進行神經活檢，發現DNP患者神經纖維數量明顯降低，認為神經纖維丟失是導致DNP發病的關鍵因素〔4〕。有研究指出，在對DNP患者神經結構進行觀察時發現，該類患者存在神經周圍血管基底膜增厚及神經內膜血管缺損情況，認為在DM患者中存在較為嚴重的軸突萎縮或節段性脫髓鞘情況〔5〕。TIG由α和β亞基組成，可對細胞表面配體或細胞外基質配體進行識別。在大鼠感覺神經中存在ITGβ1廣泛表達情況，可在結合細胞外基質后發揮生物效應。ITG的眾多配體中包含層黏連蛋白，可使ITG亞基的mRNA上調，對軸突中相應蛋白的免疫反應產生影響，在神經突觸再生過程中發揮著非常重要的作用〔6〕。有研究指出，周圍神經系統髓鞘化速度會因ITGβ1等表達升高而呈現速度加快情況〔7〕。也有報道指出，缺乏α7亞基會降低小鼠外周神經損傷后的再生能力〔8〕。本研究結果提示，ITGB1/FAK/AKT通路與DM神經病變存在密切聯系。

ErbB受體酪氨酸激酶(RTK)與ITG之間可產生相互作用，根據其作用方式不同可將其分為兩種情況，一種是相互之間的協作關系，RTK及ITG在激活過程中均需要相應配體的支持，然后兩者下游共同靶點FAK對兩者之間的協作進行介導。已有大量研究指出，ErbB2和ITG在腫瘤細胞中的串擾關系。過表達的ErbB2受體可導致上皮腫瘤細胞系中α5β1表達升高，進而對于細胞存活起到改善作用〔9～11〕。有報道指出，ErbB2通過激活轉移乳腺癌細胞中的磷脂酰肌酸-3激酶(PI3K)/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)和蛋白激酶(PK)B信號通路，影響整聯蛋白β1活性，使膠原蛋白表面的黏附和擴散受損〔12〕。ErbB2依賴的DNA合成及翻譯可收到β4 ITG的調節。對于FAK及Src的特異性磷酸化NRG-1β可以起到誘導作用，促進蛋白質復合物的產生，對于心肌細胞伸長縱向的片狀偽足可以起到促進作用〔13〕。本研究結果顯示，外源性NRG-1可使DM大鼠DRGs細胞中的ITGB1及相關蛋白表達上調，對于神經元軸突再生起到促進作用。GAP-43可參與突觸前囊泡功能，對于軸突重建及結構可塑起到促進作用，而Tau蛋白在細胞信號傳導、凋亡及神經細胞支架蛋白形成過程中均發揮著非常重要的作用。在大鼠和兔眼內進行43 kD多肽注射，8 d后可在遠端神經束內檢測到，且軸突向外生長與GAP-43 mRNA分布或蛋白質表達存在密切聯系，而這與突觸前重排和神經元損傷有著密切聯系〔14，15〕。GAP-43在高Ca2+環境內可被PKC磷酸化，在與其他蛋白進行反應后，影響囊泡循環及軸突伸長。Tau是一種神經元軸突微管裝飾蛋白，對于運動系統的軸突運輸具有調節作用。高度激活的磷酸化Tau會導致軸突轉運受損，圍觀動態失衡。有報道指出，對坐骨神經損傷大鼠進行淫羊藿次苷Ⅱ治療，可有效提高Tau蛋白表達，促進微管形成，對于神經再生微環境可以起到調節作用〔16〕。并且在研究中指出，在完成軸突再生后Tau表達逐漸恢復至正常水平。本研究在對糖尿病大鼠進行NRG-1刺激時發現，NRG-1可促進大鼠神經突觸生長，且20 ng/ml為最佳濃度。NRG刺激可使DRGs細胞軸突生長能力增強。

綜上，對于1型DM大鼠背根神經節神經元軸突生長NRG-1干預可起到促進作用，猜測NRG-1可能是通過調節ITGB1/FAK/AKT通路發揮作用。