HA復合β-TCP在新西蘭兔上頜竇提升術中的成骨及成血管效果

張艷波 霍峰 王雪峰 韓尚志 張興樂 王鵬

(承德醫學院附屬醫院口腔科，河北 承德 067000)

由社會老齡化、面部創傷、腫瘤切除、先天性畸形及炎癥等因素導致的上頜后區骨量不足以致牙槽骨骨缺失是口腔臨床醫學面臨的重大挑戰之一。在上頜竇提升術中，有效的修復及重建骨缺損是使患者免于疾病困擾的慣用治療方案〔1〕。研究顯示〔2〕，自體骨移植修復材料能明顯促進骨的再生和愈合，是修復缺失骨的“金標準”，但是該方法需要從患者身體其他部位獲取，患者要承受新的疼痛或者神經創傷，誘發較為強烈的炎性應激等并發癥，并且由于自體骨的增殖能力有限，難以滿足臨床上較大的骨需求量。大量的臨床數據顯示〔3〕置入式骨替代材料在硬組織修復中具有潛在的廣闊前景。研究顯示〔4〕羥基磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)等替代骨材料常被骨外科醫師用于骨增量手術中。有研究報道〔5〕，HA具有明顯的生物相容性優勢，可為骨再生提供較為穩定的支架作用，但是其被生物降解的過程緩慢，嚴重影響初期骨的形成。有研究報道稱〔6〕，β-TCP在骨組織修復中顯示了更好的生物降解速率，但其作為支架作用的缺點同樣較為明顯，無法在3～6個月的骨組織重建過程維系骨替代材料降解與成骨過程的平衡。Sakamoto等〔7〕研究表明將HA復合β-TCP應用到骨重建術中，顯示了較為滿意的成骨效果。但是HA復合β-TCP材料用于上頜骨的修復的報道較少。本研究探討HA復合β-TCP對新西蘭大白兔上頜竇提升術中的成骨和成血管的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物、試劑和儀器 動物：雌性，SPF級，3月齡，體重(2.5±0.5)kg，31只，健康新西蘭大白兔，采購自河北省望都縣彤輝養殖有限公司，動物的許可證號：SCXK(冀)2016-002，實驗動物使用許可證號SYXK(冀)2017-001。在承德醫學院實驗動物中心飼養房中，恒溫恒濕條件下，標準顆粒飼料，自由飲水，單籠飼養，至少進行適應性喂養1 w后用于后續實驗。本研究的實驗操作均符合醫學院動物倫理委員會的要求，已獲取承德醫學院動物倫理委員會的批準。主要試劑：HA復合β-TCP(HA和β-TCP的比例為3∶7)購自國家生物醫學材料工程技術中心。β-TCP、麻醉劑、磷酸鹽緩沖液(PBS，北京Solarbio公司)，兔抗大鼠GAPDH(北京博奧森生物技術公司)；蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(美國Amresco公司)，免疫組化、Western印跡試劑盒(美國millipore公司)，茜素紅、油紅O染色試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。主要儀器：掃描電鏡(日本HITACHI 公司)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)，酶標儀(北京六一儀器廠)，FACS Aria Ⅲ流式細胞儀、凝膠電泳儀(美國BD公司)。

1.2電鏡觀察HA復合β-TCP生物材料的特性 在實驗前將無菌真空包裝的HA復合β-TCP材料切成直徑3 mm，高度為5 mm的形狀，電鏡下觀察復合材料的微觀結構。

1.3細胞實驗部分

1.3.1新西蘭大白兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)分離、鑒定與培養 取1只實驗動物，靜脈注射30 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉后，剝離大白兔的股骨〔8〕，PBS沖洗3次，將沖洗出來的骨髓離心，棄上清，以濃度為15%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液重懸細胞，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，每隔1 d更換一次培養，并在顯微鏡下隨時觀察細胞的形態及生長變化當細胞的生長密度超過90%時，0.25%胰酶消化，用于后續實驗。BMSCs的表面抗原鑒定通過流式細胞儀進行，胰酶消化細胞后，1 500 r/min離心3 min，PBS洗滌，以100 μl的PBS重懸細胞，加入一抗(CD29、CD34、CD44、CD45)，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，加入二抗，避光孵育2 h，FACS Aria Ⅲ流式細胞儀檢測〔9〕。

1.3.2細胞實驗分組及HA復合β-TCP材料對BMSCs的生長活性的影響 胰酶消化細胞后，調整細胞濃度為1×104個/孔接種于96孔培養板中，將細胞分為空白組(不進行任何處理)、對照組(細胞的培養基中添加1%的β-TCP后培養)〔10〕、實驗組(細胞的培養基中添加1%的HA復合β-TCP材料)，每組設18個復孔，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h，接著每孔加入100 μl的CCK-8工作液，室溫孵育1 h，使用酶標儀〔11〕在12、24、36、48、60、72 h時各取3個孔測量D450。

1.3.3HA復合β-TCP材料對BMSCs的成骨分化的影響 胰酶消化細胞后，更換為成骨誘導培養基同時調整細胞濃度為1×104個/孔接種于96孔培養板中，分組同1.3.2，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，每隔1 d更換培養基，培養14 d后，按茜素紅、堿性磷酸酶染色試劑盒〔12〕，染色，封片，顯微鏡下觀察BMSCs的成骨和成血管狀況。

1.4動物實驗部分

1.4.1新西蘭大白兔的上頜竇提升術 將實驗動物按隨機數字表法分為空白組、對照組、實驗組，每組10只；實驗動物禁食禁水12 h后，耳靜脈注射戊巴比妥鈉將動物麻醉后〔13〕，嚴格按手術要求在鼻部術區備皮，消毒，與動物鼻后1.5 cm處行縱行切口，在無菌顯微剪的幫助下，分開兩側皮膚，暴露大白兔的鼻翼區，使用環形去骨鉆在上頜竇頂壁制備以直徑為0.5 cm的骨窗，取下骨片，分開上頜竇黏膜，復制出5 cm×5 cm×5 cm的空間：空白組在該處填充醫用生理鹽水和明膠海綿；對照組在該處填充1%β-TCP、醫用生理鹽水和明膠海綿；實驗組在該處填充1%的HA復合β-TCP材料、醫用生理鹽水和明膠海綿，蓋上自體骨，縫合骨膜，肌注20萬U的青霉素防止感染。

1.4.2HE染色檢側實驗動物上頜竇組織的形態改變 所有大白兔在術后單籠，標準飼料喂養28 d后，處死動物，無菌分離實驗動物的上頜竇組織。以多聚甲醛固定， 置于脫鈣液中3個月，每3 d更換脫鈣液，待醫用大頭針能輕易穿刺標本后〔14〕，脫水，切片，HE染色，顯微鏡下觀察標本中的成骨和成血管情況。

1.4.3免疫組化檢側各組標本中的微血管密度(MVD) 待各組標本脫鈣后，常規脫水，切片，采用檸檬酸鹽緩沖液高溫修復抗原，5%山羊血清封閉，加入一抗CD31(1∶500)〔15〕，4℃孵育過夜，加入二抗，PBS潤洗3次，蘇木精復染， 二甲苯脫水，封片，上鏡檢測。

1.4.4Western印跡檢測各組標本中成骨相關蛋白成骨基因特異性轉錄因子(Runx)2、骨橋蛋白(OPN)及血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平 待各組標本脫鈣后，經常規裂解、勻漿、離心后，測定蛋白濃度，電泳分離，轉模、封閉〔12〕，滴加一抗(均為1∶500)，4℃孵育過夜，次日清洗后加入二抗(均為1∶1 000)，顯色，凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值〔16〕，參照GAPDH的表達計算目的蛋白相對表達水平。

1.5統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行方差分析，t檢驗，作圖工具采用Graphpad5.01。

2 結 果

2.1電鏡下觀察復合材料的微觀結構 掃描電鏡觀察顯示，HA復合β-TCP材料內部的微孔(直徑300～500 μm)和超微孔(直徑1 μm)數量豐富，孔徑率在85%左右，視野中的微孔均在內部鏈接緊密，為新血管以及骨骼的形成提供足夠的空間和營養，見圖1。

2.2BMSCs的培養與鑒定 光學顯微鏡下，BMSCs多為長梭形、橢圓形或多邊形，貼壁生長呈現旋渦狀、魚群狀排列；BMSCs表面陽性標記物CD29(62.78±2.94)%，CD44(93.73±9.18)%，呈現高表達的狀態，而CD34，CD45均為陰性表達，這些結果說明所提取的細胞為BMSCs，見圖2。

2.3HA復合β-TCP材料對BMSCs的生長活性的影響 3組細胞的OD值無明顯差異(P>0.05)，說明3組細胞的生長的增殖活性趨于一致，進而顯示HA復合β-TCP材料對BMSCs無毒性，見表1。

圖1 電鏡掃描生物材料的微觀結構

圖2 BMSCs的培養與鑒定

表1 各組細胞的OD值

2.4HA復合β-TCP材料對BMSCs的成骨分化的影響 空白組細胞中未見明顯的礦化結節，對照組細胞中可見少量的礦化結節，實驗組細胞中可見較多的礦化結節，3組細胞的礦化結節數量的差異具有統計意義(均P<0.05)，見圖3，表2。

圖3 各組BMSCs茜素紅染色(×400)

2.5HA復合β-TCP材料對BMSCs的成骨中血管生成的影響 空白組細胞中未見明顯的咖啡色顆粒，對照組細胞中可見少量的咖啡色顆粒，實驗組細胞中可見較多的咖啡色顆粒，與空白組相比，對照組、實驗組細胞中堿性磷酸酶的陽性比例明顯升高，與對照組相比，實驗組細胞中堿性磷酸酶的陽性比例明顯升高(均P<0.05)，見表2，圖4。

表2 各組細胞礦化結節數量、堿性磷酸酶的陽性比例比較

圖4 各組BMSCs堿性磷酸酶染色(×400)

2.6HE染色檢側各組上頜竇組織的形態改變 空白組動物的標本中結締組織大量生成，視野中出現較多的炎性細胞浸潤，雖有少量骨質新生，但未見明顯的骨小梁；對照組動物的上頜竇組織標本中新生骨質量明顯增多，新生骨質見可見少量的血管生成和骨小梁；實驗組中新生骨質量較對照組明顯增多，新生血管數量明顯增多，炎性浸潤的細胞明顯減少，視野中的骨小梁的數量明顯增多，見圖5。

2.7免疫組化檢側各組標本中的MVD 與空白組相比，對照組、實驗組上頜竇組織中的MVD明顯增多；與對照組相比，實驗組上頜竇組織中的MVD明顯增多(均P<0.05)，見圖6，表3。

2.8Western印跡檢測各組標本中Runx2、OPN、VEGF蛋白表達 與空白組相比，對照組、實驗組上頜竇組織中Runx2、OPN、VEGF表達明顯升高；與對照組相比，實驗組上頜竇組織中Runx2、OPN、VEGF表達明顯升高(均P<0.05)，見表3，圖7。

圖5 各組上頜竇組織形態(HE染色，×200)

圖6 各組上頜竇組織MVD(HE染色，×200)

表3 各組上頜竇組織中MVD、Runx2、OPN、VEGF相對表達比較

圖7 Western印跡檢測各組相關蛋白表達

3 討 論

臨床上常采用骨移植、牽張成骨刺激、牽拉成骨促進骨再生等手段中的一種或者多種方法聯合應用以治療各種原因造成的骨缺損，由于當今醫療技術的限制及患者所能承擔的經濟負擔限制，這些干預手段但現在尚未達到令人欣慰的效果。但是在一些涉及因癌癥切除、外科創傷、先天性畸形而造成的頜面骨缺失的患者中，骨組織的修復及重建是提高患者身心健康及生命質量的重要途徑。研究顯示〔17〕，自體骨移植、同種異體骨移植及填充骨替代材料是治療頜面骨缺損的主要手段，但是由于自體骨移植、同種異體骨移植固有局限性和技術要求的嚴格性，臨床醫師對這些手段的實用性和療效保留較大的爭議。得益于當代生物材料、檢測技術及有限元建模等技術的突破性進展，填充骨替代材料成為解決臨床醫師困擾的最具前景的手段。

目前骨移植替代材料領域的發展迅速，如膠原、陶瓷、磷酸鈣水泥、β-TCP等。研究顯示〔18〕β-TCP因與骨骼具有相比的成分，在臨床的骨組織修復中具有廣闊的應用前景。Goodarzi等〔19〕通過X射線對β-TCP納米級復合材料進行表征，結果顯示β-TCP納米材料的微孔及孔徑均極大提高了大鼠BMSCs的體外相容性，增強細胞中堿性磷酸酶的活性。Hojo等〔20〕研究報道將β-TCP/膠原蛋白復合材料用于犬無骨膜壓槽骨缺損模型中，在實驗周期內β-TCP能明顯增加成骨的面積，顯示了強勁的促進骨再生和牙槽吸收的效用。Costa等〔21〕研究顯示作為生物活性材料，替代骨材料β-TCP在誘導成骨細胞的生成過程中，一方面能明顯降低機體的免疫原性和排斥反應，另一方面其特有的超微孔結構能明顯促進骨細胞的增殖，募集和分化。但是Go等〔22〕研究指出由于單一材料理化性質難以匹及復雜的機體生理變化，需要將β-TCP與其他生物活性相復合，以彌補其作為支架功能不足的掠食，以發揮其最大的成骨效用。許多材料如骨傳導性能較好的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、殼聚糖、聚己內酯、α-半水硫酸鈣(CSH)、納米HA等復合材料均已應用到這一領域〔23〕。而HA因其具有與人類骨骼組織礦物質相類似的成分，優良的骨傳導性能，降低疾病傳播的風險及方便易于結合性能等優勢而被眾多學者廣泛研究。Nascimento等〔24〕通過對Wistar大鼠顱骨缺損的研究指出HA復合β-TCP材料的應用能明顯增強填充物的生物相容性和骨傳導性，并且保留了原始的移植形狀，促進顱骨缺損的修復。但是有關HA復合β-TCP材料在頜面骨缺損修復的報道較少。本研究結果說明生物復合材料的應用能明顯增強BMSCs體外成骨的分化及成血管效用。HA復合β-TCP材料的應用能明顯緩解實驗動作缺損灶點的病理損傷，增加血管生成的數量，增強成骨和成血管相關蛋白Runx2、OPN、VEGF的表達。